[发明专利]一种构建mRNA5’端信息文库的方法

摘要

本发明属于基因组学技术领域，具体涉及一种简化CAGE‑seq建库方法。本方法采用富集含帽子结构的mRNA及lncRNA，并特异性加上5’端接头，片段化处理后，进行逆转录，进一步富集5’端信息。整个方法中糅合了现有成熟gnomegen公司RNA‑seq kit。本方法操作更简单、成功率高，也能特异性富集5’端信息，对于鉴定整个细胞内mRNA的转录起始位点，从而获得准确的启动子信息和5’UTR信息更有帮助。是研究基因表达的有力方式，适用与基因调控网络研究。

主权项

1.一种CAGE‑seq测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)用DNaseI处理RNA样品，获得无DNA污染的RNA；2)用Ambion公司，货号为61005的Oligo(dT)25磁珠富集含polyA尾巴的mRNA；3)用thermoFisher公司，货号为EF0654的fastAP酶处理mRNA，将不含5’端帽子结构保护的RNA去磷酸化，5’端变为羟基，使其后续无法加上5’接头；4)将步骤3)得到的样品用Oligo(dT)25磁珠纯化；5)用enpicentre公司，货号为T81050的TAP酶将含5’端帽子结构的mRNA进行去帽子结构处理，5’端变为单磷酸基团；6)将步骤5)得到的样品用Oligo(dT)25磁珠纯化；7)将富集到的去帽子结构的mRNA加5’接头，所述的5’端接头是gnomegen公司的RNA‑Seq Library Preparation Kit for Whole Transcriptome Discovery，货号为K02421中提供的；8)将步骤7)得到的样品用Oligo(dT)25磁珠纯化；9)将步骤8)得到的样品在95℃温育5min，进行片段化处理，用Gnome Size Selector纯化片段化后样品；10)使用随机引物对片段化处理的样品进行逆转录合成cDNA，所述随机引物包含6个随机碱基及一段已知接头序列，所述已知接头序列和gnomegen公司试剂盒中的PCR体系的引物之一互补；11)采用步骤2)的gnomegen公司试剂盒中的PCR体系，试剂盒中与5’端接头匹配的引物和3’端随机引物匹配的引物，进行PCR扩增，得到CAGE‑seq测序文库，只有5’端连接有接头的序列，才能扩增出文库。