[发明专利]一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法

摘要

本发明属于植物保护技术领域，提供了一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法，该方法包括：获取待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息；根据所述待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息，应用测定模型确定与所述待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息对应的条锈病菌DNA相对含量；所述测定模型为表示近红外光谱信息和条锈病菌DNA相对含量之间的对应关系的模型。本发明提供的小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法可快速、准确、定量的对小麦条锈病潜育期叶片内条锈病菌DNA相对含量进行测量。

主权项

1.一种小麦潜育期叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法，其特征在于，所述方法包括：S0、构建测定模型；S1、获取待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息；S2、根据所述待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息，应用所述测定模型确定与所述待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息对应的条锈病菌DNA相对含量；所述测定模型为表示近红外光谱信息和条锈病菌DNA相对含量之间的对应关系的模型；其中，所述步骤S0包括如下细分步骤S01至S03：S01、对小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱进行采集，得到样品的近红外光谱；S02、计算所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量，即Pst DNA；小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量的计算方式为：S03、根据所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量和所述样品的近红外光谱，构建条锈病菌DNA相对含量测定模型；进一步地，所述步骤S01具体如下：采用积分球漫反射法采集小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱，得到样品的近红外光谱；将每组小麦条锈病潜育期叶片样品剪成碎末状，倒入内径为20mm的样品杯中，在室温下利用MPA傅里叶近红外光谱仪进行近红外光谱采集；采集光谱方式为积分球漫反射，每次采集30条光谱；光谱采集范围为4000‑12000cm^‑1，光谱分辨率为8cm^‑1，扫描次数32次；整个采集过程直至夏孢子突破叶片表皮，此时潜育期结束；进一步地，所述步骤S02包括如下细分步骤S021至S024：S021、分别提取健康小麦叶片DNA、条锈病菌夏孢子DNA和所述小麦条锈病潜育期叶片样品DNA，得到所述健康小麦叶片DNA含量、所述条锈病菌夏孢子DNA的含量和所述小麦条锈病潜育期叶片样品DNA的含量；S022、根据所述健康小麦叶片DNA含量、所述条锈病菌夏孢子DNA含量，采用多重荧光定量PCR技术，建立所述健康小麦叶片DNA的标准曲线、所述条锈病菌夏孢子DNA的标准曲线；S023、根据所述小麦条锈病潜育期叶片样品DNA的含量，利用所述健康小麦叶片DNA的标准曲线、所述条锈病菌夏孢子DNA的标准曲线，计算所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA和小麦叶片DNA；S024、根据所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA和小麦叶片DNA，计算所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量；其中，多重荧光定量PCR技术中使用的引物和探针序列如下：步骤S022中建立DNA标准曲线的过程为：(1)将在步骤S021中提取的已知浓度的条锈病菌DNA依次梯度稀释为1、10^‑1、10^‑2、10^‑3、10^‑4ng/μL；已知浓度的小麦叶片DNA依次梯度稀释为10、1、10^‑1、10^‑2ng/μL，采用多重荧光定量PCR技术定量分析并记录Ct值；(2)分别以条锈病菌夏孢子DNA和健康小麦叶片DNA浓度对数值为纵坐标，Ct值为横坐标，获得各自标准曲线及线性回归方程；所建立的条锈病菌夏孢子DNA的标准曲线方程为y＝‑0.3019x+7.4752，R²＝0.9926，其中，y为条锈病菌DNA浓度常用对数log10值，x为Ct值；健康小麦叶片DNA的标准曲线方程为y＝‑0.3008x+9.2660，R²＝0.9989，其中，y为小麦叶片DNA浓度常用对数log10值，x为Ct值；进一步地，所述步骤S03包括如下细分步骤S03`1至S03`3：S03`1、从所述样品的近红外光谱的波长点光谱特征中随机选取m个特征，并将主成分数设置为n，其中，m、n均为预设常数；S03`2、根据所述m个特征和所述设置为n的主成分数，依次构建k个QPLS测定模型；S03`3、将所述k个QPLS测定模型的预测值作为变量，构建SVR测定模型，从而获得kQPLS‑SVR测定模型；还包括对条锈病菌DNA相对含量kQPLS‑SVR测定模型的效果进行评价，包括步骤A1至A4：A1、根据预设比例，将所述小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱，分成训练集和测试集；A2、根据所述训练集和所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量，组合采用定量偏最小二乘法QPLS和支持向量回归机SVR，构建kQPLS‑SVR测定模型；A3、根据所述训练集、所述测试集的决定系数R²、校正标准差SEC、预测标准差SEP、平均相对误差AARD和相对预测偏差SEP，对所述kQPLS‑SVR测定模型进行评价，得到评价结果；A4、根据所述评价结果，选择最优的kQPLS‑SVR测定模型；其中，小麦条锈病菌DNA相对含量kQPLS‑SVR测定模型建立的算法流程为：首先，从2100个波长点光谱特征中随机选择m个特征，将主成分数设置为n，构建一个QPLS模型，按照这种方法共构建k个QPLS模型；其次，将上述所构建的k个QPLS模型预测值作为变量，用于构建SVR模型，从而获得kQPLS‑SVR测定模型；在构建SVR模型时，以径向基函数RBF作为核函数建立SVR模型，利用网格搜索算法grid search algorithm，在2^‑8～2⁸范围内以0.8为步距搜索优化惩罚参数C和核函数参数g，选择模型的均方误差MSE最小时的参数搜索结果作为模型最优参数；选择的波长点特征数m为700，构建QPLS模型时的主成分数n为8，所构建的QPLS模型数k为5；以上计算过程均在软件MATLAB 7.8.0(R2009a)中进行。