[发明专利]一种中缅树鼩脂肪细胞的流式细胞样品制作方法

摘要

本发明涉及细胞样本制作领域，具体涉及一种中缅树鼩脂肪细胞的流式细胞样品制作方法。本发明方法利用4％多聚甲醛进行细胞固定，0.05％Tween进行细胞打孔，制作中缅树鼩脂肪细胞流式样本。使用本发明方法，能有效解决一般情况下细胞通透时造成的大量脂肪细胞破碎，以及离心转速对固定的脂肪细胞造成的破碎的问题，成功制作出符合流式上机要求的脂肪细胞样品，为细胞检测技术提供方法依据。

主权项

一种中缅树鼩脂肪细胞的流式细胞样品制作方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)动物断颈处死后，分别取下树鼩肩胛、耳后、腋下褐色脂肪组织，与腹部大网膜、腹股沟白色脂肪组织，随后将其泡在PBS中，并将组织上沾着的毛洗掉；(2)将上述组织置于2mL的离心管中，加1mL 0.25％不含EDTA的胰酶，用平剪将组织剪碎，约1mm³大小，将剪碎的组织块转移至15mL离心管中，加入胰酶补至4mL，放入37℃水浴锅中温浴，每隔10min摇晃一次，显微镜下观察组织块消化成单细胞的程度，共50‑70分钟；若样品较为粘稠，1000rpm离心10min仍不能离下沉淀，则补PBS至10mL离心，1500rpm，10min，弃上清液，保留沉淀；(3)将步骤(2)中留取的沉淀用10mL PBS重悬一下，将大的组织块剔除，离心1000rpm，10min，弃上清液，留少量PBS将松散的沉淀吹散，吸出至新的2mL离心管中，将血细胞剔除，重复用PBS洗一次；(4)用4％预冷的多聚甲醛将上述细胞重悬，4℃固定过夜，并将固定过夜的细胞用移液枪重悬起来，剔除大的组织块，离心1000rpm，10min，4℃，弃上清液，保留沉淀；(5)将步骤(4)留取的沉淀用1mL PBS重悬，离心，1000rpm，10min，4℃，弃上清液，保留沉淀；(6)在步骤(5)留取的沉淀中加1mL含0.05％的Tween细胞打孔剂，将细胞重悬，打孔30min；(7)离心800rpm，10min，弃上清液，保留沉淀，并用PBS洗一遍细胞，加50‑100μL的PBS混匀细胞，加入适量的UCP1一抗，室温孵育40min；(8)加PBS至1mL混匀，离心800rpm，10min，加PBS洗一遍；(9)按1：2000的比例加入二抗，避光，室温孵育40min，PBS洗一遍，加PBS至1mL，即可。