[发明专利]棘胸蛙快速无损伤取样方法

摘要

本发明公开了一种棘胸蛙快速无损伤取样方法，本发明通过棘胸蛙空腔表皮细胞及分泌粘液的特点，运用自制的灭菌塑料膜棉签，对棘胸蛙口腔内细胞进行取样，将取出的口腔细胞放入离心管，加入PBS，使口腔细胞充分融入PBS中，然后用试剂盒genomic DNA Mini Kit提取样本DNA。本发明的棘胸蛙快速无损伤取样方法具有对棘胸蛙机体损伤小、取样速度快、死亡率低、提取DNA效果好、方法简便、易于操作等特点。

主权项

1.棘胸蛙无损伤取样方法，其特征在于包括如下步骤：1)、利用灭菌后的塑料膜棉签黏取蛙的口腔粘液；灭菌后的塑料膜棉签的制备方法为：取顶部带有棉花头的棉签；先将塑料膜进行高压湿热蒸汽的灭菌处理，得灭菌塑料膜；再将灭菌塑料膜包裹在棉签上的棉花头上后进行高压湿热蒸汽灭菌，得灭菌后的塑料膜棉签；2)、将黏取了蛙口腔粘液的棉签放入至装有190～210μL磷酸缓冲盐溶液的离心管中，搅拌均匀；所述磷酸缓冲盐溶液为pH7.2-7.4、0.01M的PBS；3)、用试剂盒genomic DNA Mini Kit提取样本DNA：向步骤2)所得的离心管中加入170～190μL基因消化缓冲液和20μL蛋白酶K，充分混合，弃棉签；然后，于55±1℃恒温1～2h；4)、将步骤3)的所得物于11000～12000rpm离心3～4min，将离心所得的透明液体转至另一个离心管中；5)、在步骤4)所得的装有透明液体的离心管中加入19～21μL RNase A，混匀后室温静止孵育1.5～2.5min；然后再加190～210μL细胞溶解缓冲液混匀；接着再加入190～210μL无水乙醇混匀；6)、将步骤5)所得的离心管中的全部溶液加入柱式集合管，弃离心管；7)、室温，将步骤6)所得的柱式集合管8000～12000rpm离心1～1.5min；8)、取出步骤7)所得的柱式集合管内的吸附柱，将该吸附柱放入另一个柱式收集管中；加480～520μL洗涤缓冲液Ⅰ到吸附柱内，室温8000～12000rpm离心1～1.5min；9)、取出步骤8)所得的柱式集合管内的吸附柱，将该吸附柱放入另一个柱式收集管中；加480～520μL洗涤缓冲液Ⅱ，以10000～12000rpm的转速离心3～4min；取出离心所得的吸附柱进行下述步骤；10)、将吸附柱转入离心管中，加25～200μL DNA保存缓冲液，静止1～1.5min，室温，以10000～12000rpm的转速离心1～1.5min；离心所得的液体为提取的DNA。