[发明专利]一种结合瓶外生根技术的羽扇豆“画廊”叶片快繁方法

摘要

一种结合瓶外生根技术的羽扇豆“画廊”叶片快繁方法，涉及羽扇豆“画廊”种苗快繁和优良遗传性状保存技术，尤其是一种结合愈伤组织诱导和瓶外生根培养产生再生植株的方法，包括叶片处理、愈伤组织诱导、分化培养、增殖培养与再分化、瓶外生根培养及移栽定植。本发明采用离体叶片诱导愈伤组织，再通过愈伤组织分化产生不定芽，继而结合瓶外生根培养获得再生植株的方法。采用本发明方法，叶片污染率小于5%，愈伤组织诱导率72.8%，芽分化率79.5%，增殖与再分化率83.6%，瓶外生根成活率85.3%，移栽成活率92.5%。有效解决羽扇豆“画廊”种苗生产需求和优良单株无性繁殖问题，可用于规模化生产及优良遗传性状高效保存。

主权项

一种结合瓶外生根技术的羽扇豆“画廊”叶片快繁方法，包括叶片处理、愈伤组织诱导、分化培养、增殖培养与再分化、瓶外生根培养及移栽定植步骤，其特征在于，所述方法步骤为：(1)剪下离叶尖2/3的幼嫩叶片，用流水冲洗30min，通过主脉横切成1cm宽的片状；在超净工作台上，先用75％酒精消毒10s，无菌水漂洗2次；再用10％的NaOCl磁力搅拌5min，无菌水漂洗5次；然后用0.1％的升汞溶液消毒3min，无菌水漂洗5次；最后用无菌滤纸吸干叶片表面水分；切断叶缘，以横切主脉的形式切成3mm×3mm块状，并在主脉上横切2～3个切口；(2)将处理好的叶片背面朝下接种到愈伤组织诱导培养基MS+6‑BA 0.5mg/L+ZT 1.0mg/L+PVP 5.0mg/L+VC 1.0mg/L上；接种后先在22℃的恒温恒湿培养箱中进行暗培养15d；再进行光照培养，15～20d产生黄绿色疏松透明的愈伤组织；其中，MS是培养基，6‑BA是6‑苄氨基嘌呤，ZT是玉米素，PVP是聚乙烯吡咯烷酮，VC是抗坏血酸；(3)当愈伤组织长到1mm或稍大些时，及时转移到分化培养基MS+6‑BA 0.8mg/L+ZT 0.6mg/L+IAA 0.2mg/L+水解酪蛋白(CH)300mg/L+PVP 5.0mg/L+VC 1.0mg/L上；继续光照培养，20～25d形成浅绿色质地致密的愈伤组织，并在愈伤组织上分化出绿色芽点；其中，MS是培养基，6‑BA是6‑苄氨基嘌呤，ZT是玉米素，IAA是3‑吲哚乙酸，PVP是聚乙烯吡咯烷酮，VC是抗坏血酸；(4)切下愈伤组织上生长的绿色芽点，接种到增殖与再分化诱导培养基MS+6‑BA 1.5mg/L+NAA 0.25mg/L+AC 2.0g/L+GA3 1.0mg/L上；继续光照培养，25～30d可分化出健康丛生芽；其中，MS是培养基，6‑BA是6‑苄氨基嘌呤，NAA是α‑萘乙酸，AC是活性炭，GA3是赤霉素；(5)将产生的2～3cm健康单个芽切下，先在生根液中浸泡3min，再扦插至装有营养基质的育苗袋后置于温室大棚；扦插后的15d内大棚相对空气湿度保持在85％以上，温度控制在15℃～25℃；扦插20d后，每10d用1/2MS大量元素母液作为肥料进行喷洒一次，连续喷洒3次；育苗袋为无底蜂窝育苗袋，规格是8cm×13cm×350孔；营养基质的体积比是腐叶土:红壤土:骨粉＝6:2:2；营养基质事先充分暴晒后，用1000倍甲基托布津消毒，薄膜覆盖，7d后扦插；20d可见明显生根，30～35d可见新芽生出，50d后即可移栽定植；所述生根液为NAA 300mg/L+VB1 0.15g/L，其中，NAA为α‑萘乙酸，VB1是维生素B1；(6)将步骤(5)生长良好的幼苗进行定植，营养钵规格为25cm×20cm，营养土按体积比为表层田土:泥炭土＝5:2比例混合均匀；栽种选择下午进行，及时浇灌封口水，连续3天注意保持土壤湿润。