[发明专利]基于16SrDNA深度测序检测不同大豆根际土壤原核微生物的方法

摘要

本发明属于土壤微生物学技术领域，具体涉及基于16SrDNA深度测序检测不同大豆根际土壤原核微生物的方法。该方法由以下步骤构成1.采集不同大豆在各发育时期的根系抖落土壤及根际土壤；2.从土壤中提取微生物宏基因组DNA；3.用双标签引物做PCR扩增上述DNA中16S rDNA第四高变区,以构建文库；4.对合格文库用Illumina Miseq平台做双末端250个核苷酸的边合成边测序，得到纯净READS；5.拼接，每样品产出至少3.8万条有效TAG用于聚类成可操作分类单元；6.物种组成、结构、多样性及相对丰度差异显著性分析；7.以根系抖落土壤作为系统对照，准确测定根际土壤原核微生物群落组成、结构、多样性、相对丰度，并比较不同大豆之间的异同。

主权项

一种基于16SrDNA深度测序检测不同大豆根际土壤原核微生物的方法，其特征是由以下步骤构成：(1)大田试验地设计，每一种基因型大豆种植于三个或三个以上小区，每个小区面积不小于12m²，每个小区有两个取样点，每个取样点取两棵或两棵以上植株；(2)先除去地面杂草和枯枝落叶，铲除大田土壤表面1‑2cm的表土，然后将在盛花期或苗期或鼓粒期或成熟期的大豆植株连根从土中取出，用抖落法取根系抖落土作为系统对照，混合均匀并去除根毛，于零下20℃‑零下70℃保存，再用捋取法取下紧粘于大豆根的根际土壤，混合均匀并去除根毛，并于零下70℃保存；(3)从上述各土壤样品中，用可去除土壤中残留的腐殖质及几乎所有其他的PCR抑制因子的PowerSoil DNA Isolation Kit提取高质量微生物宏基因组DNA；(4)用双标签融合引物对，其一含P5Illumina接头序列、8核苷酸的标签以及特异性引物515F，515F的核苷酸序列是5‘‑GTGCCAGCMGCCGCGGTAA‑3’，另一引物含P7Illumina接头序列、8核苷酸的标签以及特异性引物806R，806R的核苷酸序列是5‘‑GGACTACHVGGGTWTCTAAT‑3’，做PCR扩增所述宏基因组DNA中16S rDNA的V4高变区片段以构建文库；(5)对合格的文库用Illumina Miseq平台进行双末端250个核苷酸边合成边测序的深度测序，并对边合成边测序的读取序列READS进行质量控制；(6)把纯净的成对READS拼接成TAG，然后聚类成“可操作分类学单元”，英语缩写为OTU，再做物种组成、结构、多样性及相对丰度差异的显著性分析；(7)以根系抖落土壤微生物群落的组成、结构及多样性作为系统对照，克服土壤异质性的影响，准确测定根际土壤原核微生物群落组成、结构、多样性、相对丰度，比较不同大豆之间的异同。