[发明专利]一种乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法

摘要

本发明公开了一种乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法，采用牙髓组织块切碎后直接用间充质干细胞无血清培养基培养的方法，简单、快捷、经济，能够更好地保持细胞活力，减少污染的机会，且培养过程中几乎不引入杂质，对细胞的机械损伤和化学损伤少；本发明采用的均是无血清培养体系，获得的间充质干细胞可以直接用于临床或科研使用；获得的干细胞生物活性高及干性强，阳性指标表达率达98％以上，阴性指标表达率低于2％。

主权项

一种乳牙牙髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：一、乳牙牙髓间充质干细胞的分离及扩增培养(1)将在医院检验合格且进行过初步清洗消毒的自然脱落或是人工拔除的乳牙转运至实验室；(2)在超净工作台中，对乳牙进行二次清洗消毒灭菌，用液压钳压碎乳牙，取出牙髓组织，将牙髓组织切碎后用间充质干细胞无血清培养基培养，获得牙髓组织混合液；(3)将获得的牙髓组织混合液在温度为37℃，CO2体积分数为5％的培养箱中培养；(4)在培养的第7～10天，更换培养基，以后每2～3天对培养基进行三分之一换液，培养至12～17天时，细胞汇合率达到70～80％时，进行传代培养；二、乳牙牙髓间充质干细胞的冷冻保存(5)当传代细胞的汇合率达到70％～80％时，将传代细胞吸出培养基，加入质量分数为0.05％的胰蛋白酶消化1～3min，离心收集细胞，用间充质干细胞无血清培养基重悬细胞沉淀得到细胞悬液；(6)将细胞悬液与DMSO冻存液按体积比为4：1混合，得到冻存细胞液，调整冻存细胞的浓度为2～5×10⁶/ml；(7)将冻存细胞液放入程序性降温盒中在‑80℃冰箱降温，隔夜后转入液氮罐中长期储存。