[发明专利]一种用于区分萝卜品种的RAPD引物及其应用

摘要

本发明公开了一种用于区分萝卜品种的RAPD引物及其应用，属于分子生物学分子标记领域。该方法通过设计筛选出的4个RAPD随机引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～3所示，用于扩增未知萝卜品种的DNA，通过统计凝胶电泳后的谱带，区分出具有唯一特异性谱带的品种，并建立被区分品种的树形鉴别图。本发明的引物提高了RAPD反应的稳定性，操作简便，高效准确，节省引物，仅通过4次PCR就可轻松的将“满身红”等20个萝卜品种在分子水平上进行快速区分，所得到的品种鉴定图比聚类树更具有直观性，即根据品种鉴定图就可以快速找出能区分任意两个品种的引物，该方法可以实现萝卜种苗早期鉴定，在其他物种上也具有广泛的通用性。

主权项

1.用于区分萝卜品种的RAPD引物在区分萝卜品种中的应用，所述用于区分萝卜品种的RAPD引物的序列如下：RP13：5’‑TATGTCTACTC‑3’；RP102：5’‑CTAGGATTATT‑3’；RP55：5’‑TATTATTGGCT‑3’；RP271：5’‑ACGGTGCGGCG‑3’；所述萝卜品种包括：满身红，霸王青，短叶十三，秋田扬花，秋田大红袍，秋田满堂红，穿心红，绵阳红，银魅，丰秋青王，扬州圆白，青皮甜帅，七叶圆红，浙大长，翘头青，南韩大根，韩玉春，西南红帅，中秋红，白玉春；包括如下步骤：(1)提取萝卜叶片基因组DNA；(2)利用RP13引物对步骤(1)得到的基因组DNA进行RAPD扩增，得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，若在1800bp、1200bp处都出现特征性谱带，而在750bp无特征性谱带，萝卜的品种为“满身红”；若在1800bp、1200bp、750bp处都出现特征性谱带，萝卜品种为“秋田扬花”；(3)若琼脂糖凝胶电泳检测结果与步骤(2)不符，则利用RP102引物再对基因组DNA进行RAPD扩增，若利用RP13引物扩增时，在1200bp处出现特征性谱带，而在1800bp、750bp处未出现特征性谱带，RP102引物扩增后使用如下方法判断萝卜品种：若在1000bp未出现特征性谱带的，其品种为“秋田大红袍”；若在1000bp、150bp都出现特征性谱带，而在400bp处未出现特征性谱带，其品种为“秋田满堂红”；若在1000bp、400bp、150bp处都出现特征性谱带，其品种为“南韩大根”；若在1000bp、400bp都出现特征性谱带，而在150bp未出现特征谱带，则进入步骤(4)；若在400bp、150bp均未出现特征性谱带，而在1000bp出现特征谱带，则进入步骤(5)；若利用RP13引物扩增时，若在1800bp处出现特征性谱带，而在1200bp、750bp处未出现特征性谱带，利用引物RP102扩增后使用如下方法判断萝卜品种：经琼脂糖凝胶电泳检测在600bp、250bp均出现特征性谱带，其品种为“西南红帅”；若在600bp出现特征性谱带，而250bp未出现特征性谱带，则进入步骤(6)；若利用RP13引物扩增时，在1200bp、750bp处出现特征性谱带，而在1800bp处未出现特征性谱带，利用引物RP102扩增后使用如下方法判断萝卜品种：经琼脂糖凝胶电泳检测在100bp处出现特征性谱带，而在1800bp、400bp处未初现特征谱带的为品种“青皮甜帅”；若在1800bp处出现特征性谱带，而在400bp、100bp处未初现特征谱带的为品种“翘头青”；若在1800bp、400bp均出现特征谱带，而在100bp未出现特征谱带，则进入步骤(7)；(4)利用RP102引物进行RAPD扩增，若在1000bp、400bp都出现特征性谱带，而在150bp未出现特征谱带，RP55引物扩增后使用如下方法判断萝卜品种：若在1000bp出现特征性谱带的，其品种为“短叶十三”；若在250bp出现特征性谱带的，其品种为“银魅”；若在3000bp、500bp均出现特征性谱带的，其品种为“中秋红”；(5)利用RP102引物进行RAPD扩增，若在400bp、150bp均未出现特征性谱带，而在1000bp出现特征谱带，RP55引物进行RAPD扩增后使用如下方法判断萝卜品种：若在1000bp与200bp处均出现特征性谱带的，其品种为“穿心红”；在200bp未出现特征性谱带，其品种为“白玉春”；若在1000bp处未出现特征谱带，而在200bp处出现特征性谱带，则进入步骤(8)；(6)利用RP102引物进行RAPD扩增，若在600bp出现特征性谱带，而250bp未出现特征性谱带，再用RP55引物进行RAPD扩增后使用如下方法判断萝卜品种：若在1200bp出现特征性谱带的，其品种为“绵阳红”；在1200bp未出现特征性谱带，其品种为“扬州圆白”；(7)利用RP102引物进行RAPD扩增，若在1800bp、400bp均出现特征谱带，而在100bp未出现特征谱带，RP55引物进行RAPD扩增后使用如下方法判断萝卜品种：若在1000bp和400bp均出现特征性谱带的，其品种为“霸王青”；在1200bp出现特征性谱带，其品种为“丰秋青王”；在250bp出现特征性谱带的品种为“韩玉春”；(8)利用RP55引物进行RAPD扩增，若在1000bp处未出现特征谱带，而在200bp处出现特征性谱带，RP271引物进行RAPD扩增后使用如下方法判断萝卜品种：若在400bp出现特征性谱带的为品种“七叶圆红”；若在400bp未出现特征谱带的为品种“浙大长”。