[发明专利]一种二氯甲烷法提取DNA的原理

摘要

本发明属于DNA提取技术领域且公开了一种有机二氯甲烷法提取DNA的原理，核DNA的提取原理是：以低渗法裂解细胞，之后通过离心收集细胞核，核内DNA通过加入SDS、Triton、Tween20等去垢剂或加热煮沸法将细胞膜、核膜破坏，使DNA从细胞核内释放，再加入蛋白酶K，水解膜蛋白和核蛋白，使DNA游离在溶液中，随后以不同的方法去除杂质，收集DNA，抽提DNA中最为经典的为有机法。传统的有机提取法(即经典的饱和酚－氯仿法)：利用有机的蛋白质变性剂酚、氯仿(三氯甲烷)交替抽提，使蛋白质变性，有效地去除蛋白质等杂质，该二氯甲烷法提取DNA的原理，克服酚的缺点，加速有机相与液相分层，最后用更加环保的另一种有机溶剂‑二氯甲烷进行抽提DNA，去除核酸溶液中的迹量酚，得到了同样高质量和高浓度的DNA。

主权项

一种二氯甲烷法提取DNA的原理，其特征在于，各种生物样本具体DNA提取操作方法：(1)血液(痕)：取血液100μl(血痕0.5cm2)置1.5ml移液器管中，加入400μl TES(10mmol/L缓冲液，pH 8.0，100mmol/L氯化钠，1mmol/L EDTA)，10％SDS 40μl，10mg/ml PK8μl，37℃水浴过液，以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25:24:1)抽提2‑4次，二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提1次。加2倍体积冷无水乙醇和1/10体积3mol/L氯化钠沉淀DNA，置‑20℃2h后10000r/min离心20min，倾去无水乙醇，70％‑75％乙醇洗涤10000rpm 5min，弃乙醇，DNA干燥后加适量ddH2O(pH 8.2)溶解备用；(2)组织：取10mg左右组织，研磨后，置1.5ml移液器管中，加入400μl TES，10％SDS 40μl，10mg/ml PK12μl，后继步骤同⑴；(3)毛根：取4‑6根带毛囊毛发(0.3cm)，置0.5ml移液器管中，加入100μl TES，10％SDS 10μl，10mg/ml PK8μl，39mmol/L DTT 10μl，后继步骤同⑴；(4)唾液斑：取唾液斑1.0‑2.0cm2，剪碎，TES浸泡1h，用灭菌牙签搅动载体以使细胞脱离载体，去载体，10000rpm离心10min，弃上清，于沉淀内加入400μl TES，10％SDS 40μl，10mg/ml PK8μl，37℃过夜或56℃两小时，后继步骤同⑴；(5)混合斑：取混合斑0.5cm2，剪碎，TES4℃浸泡2h，去载体，10000rpm离心10mm，弃上清液，于沉淀内加入400μl TES，10％SDS 40μl，10mg/ml PK8μl，52℃3h，用TES反复洗涤3次除去阴道上皮细胞，方法①再加入400μl TES，10％SDS40μl，10mg/ml PK15μl，39mm DTT40μl，37℃过夜或56℃2小时，以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25:24:1)抽提2‑4次，二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提1次。加2倍体积冷无水乙醇和1/10体积3mol/L氯化钠沉淀DNA，置‑20℃2h后10000r/min离心20min，倾去无水乙醇，DNA干燥后加适量ddH2O(pH 8.2)溶解备用；方法②加入5％CHELEX‑100100μl，10mg/ml PK10μl，39mm DTT20μl，37℃过夜或56℃2小时，剧烈振荡，100℃加热10min，剧烈振荡，10000r‑min10min，取上清液进行检测扩增；(6)骨、指甲：同血液DNA提取，骨和指甲的消化时间延长至3天到1周，蛋白酶K用量为25μl(20mg/ml)左右，消化时加入适量39mM DTT；(7)污染检材DNA提取：检材用TES液洗涤1‑2次后以酚‑二氯甲烷法提取DNA，提取的DNA经无水乙醇、3M氯化钠涫淀后再加入TES、10mg/ml PK、10％SDS进行二次消化，再以酚‑二氯甲烷法提取DNA。