[发明专利]一种基于代谢组学鉴别霍山米斛与霍山铁皮石斛品种的方法

摘要

本发明公开了一种基于代谢组学鉴别霍山米斛与霍山铁皮石斛品种的方法，具体步骤包括(1)石斛样品的采集；(2)石斛代谢组学样品的制备；(3)石斛样品代谢产物的检测；(4)代谢组学数据的处理与分析。本发明的优点在于采用代谢组学方法获得石斛大量的内源性代谢物信息，并从中筛选出鉴别霍山米斛与霍山铁皮石斛的特征性代谢产物，进而从整体上区别这两种石斛品种，技术方法先进、实验结果可靠，为石斛的品种鉴定和质量评价提供了一种优良方法。

主权项

一种基于代谢组学鉴别霍山米斛与霍山铁皮石斛品种的方法，包括如下步骤：（1）石斛样品的采集；（2）石斛代谢组学样品的制备；（3）石斛样品代谢产物的检测；（4）代谢组学数据的处理与分析；所述步骤（2）的过程包括石斛样品代谢物的提取及衍生化；所述石斛样品代谢物的提取步骤为：采用液氮研磨的方法将石斛样品磨至粉末状，每种石斛样品取六次重复；然后称取100~150mg粉末状石斛样品置于10mL离心管中，加入1.5mL预冷至‑20℃的甲醇，涡旋震荡1min后，加入60µL的核糖醇作为甲醇/水相的内标，再涡旋震荡30s，然后用石腊膜封住离心管口，于40～45℃条件下超声处理30min，8000rpm/min离心15~20min，取1mL上层溶液置于1.5mL离心管中，得到石斛样品代谢物的甲醇/水相提取溶液；所述石斛样品代谢物的衍生化，具体步骤为：用氮气吹干石斛样品代谢物的甲醇/水相提取溶液， 加入60µL浓度20mg/mL盐酸羟胺吡啶溶液，涡旋震荡30s后40℃温浴120min；随后加入60µL含体积分数1%TMCS 的BSTFA，密封后置37℃下反应120min，即得所述石斛代谢组学样品；所述步骤（3）的检测条件为：色谱条件：DB‑5石英毛细管柱，毛细管柱规格30m × 250μm× 0.25μm；进样体积为1µL；分流进样，分流比为20：1；进样口温度280℃；载气为氦气，流速1mL/min；程序升温：初始温度为100℃，保持2min，以 4℃/min 升温到 260℃，保持1min，再以20℃/min 升温到 280℃，保持3min；质谱条件：接口温度和离子源温度均为250℃；电子轰击离子源；全扫描方式，电子能量70eV，质量检测范围m/z 40‑600；所述步骤（4）代谢组学数据的处理与分析包括：将步骤（3）获得的霍山米斛与霍山铁皮石斛GC‑MS原始数据用Agilent MSD工作站打开，并转换成CDF格式文件，然后导入R2.7.2软件加载XCMS程序包进行数据的预处理，获得物质的保留时间和峰面积数据文件；用内标物质进行数据的归一化处理，归一化处理后数据导入simca‑p11.5软件进行多元统计学分析；所述多元统计学分析的具体内容为：选取PCA和OPLS‑DA模型进行主成分分析以及差异性代谢物筛选；对所获得的差异性代谢物利用NIST11数据库进行鉴定，即获得用于鉴定霍山米斛和霍山铁皮石斛的特征性代谢产物。