[发明专利]使用基因组编辑技术CRISPR-Cas9诱导CCR5Δ32缺失的方法

摘要

本发明涉及一种新的基因组编辑技术CRISPR-Cas9成功诱导细胞趋化因子受体CCR5基因突变成CCR5Δ32缺失型基因的方法。CCR5是艾滋病毒(HIV)入侵人宿主细胞重要的辅助受体。CCR5Δ32缺失为CCR5编码区发生32个碱基的缺失，导致第185位氨基酸后的序列发生改变，并且提前终止。CCR5Δ32双等位基因纯合子缺失对艾滋病毒(HIV)感染具有天然抗性，不感染艾滋病毒。本发明同时使用了慢病毒包装系统和CRISPR技术，由于慢病毒感染宿主范围广的特性，所以该发明可应用于骨髓干细胞和CD4T细胞等细胞中，有望成为治疗艾滋病或者其他疾病的药物。

主权项

使用基因组编辑技术CRISPR‑Cas9诱导CCR5Δ32缺失的方法，其特征在于使用了基因组编辑技术——成簇的、规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白CRISPR‑Cas9技术，成功诱导了CCR5Δ32缺失，该方法的具体内容包括：第一、引导RNA(gRNA)的设计为达到获得CCR5Δ32/Δ32纯合子细胞的目的，针对于CCR5Δ32两侧的目标序列设计一对gRNA，左侧的目标序列为gRNA对应的DNA序列SEQ ID No.1或者SEQ ID No.3‑19中的任一个序列，右侧的目标序列为gRNA对应的DNA序列SEQ ID No.2或者SEQ ID No.20‑36中的任一个序列；第二、根据第一步设计的gRNA，将对应的DNA插入到CRISPR‑Cas9载体质粒中，构建功能质粒,该质粒具有以下特点：①该质粒带有核酸酶Cas9表达读码框、CRISPR其他相关基因序列和慢病毒包装信号；②针对CCR5Δ32位点两侧的gRNA，如第一步所述；第三、包裹CRISPR‑Cas9质粒的慢病毒颗粒的制备：将第二步构建的CRISPR‑Cas9质粒和包装质粒PMD2.G、psPAX2共同转染到HEK293T细胞中，一段时间后收取细胞上清液，该上清中含有我们所需要的慢病毒颗粒；第四、将第三步获得的慢病毒颗粒感染目的细胞，就能够获得CCR5Δ32/Δ32纯合子细胞。