[发明专利]一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法

摘要

本发明公开了一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法，具体包括以下步骤：抽取脐带血，加入肝素抗凝，以新生儿血清或成人的血清做为媒介进行预处理；与Hank's液混合，加入分离液，离心，吸取白色雾状单个核细胞；除去红细胞，用PBS清洗，计数，接种到含培养基Ⅰ的培养瓶中；使用磁性细胞分选仪和CD34+细胞分选试剂盒分离和纯化CD34+细胞；脐血CD34+细胞重悬于培养基Ⅱ中，接种于6孔板中，培养；在培养基Ⅲ中测定CD34+扩増的细胞的造血祖细胞集落形成能力。本发明建立的培养体系及其培养条件对脐血CD34+细胞的扩增具有明显的支持作用，脐血细胞培养4周后，可大大扩増脐血CD34+细胞和CFC。

主权项

一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)脐血的采集及预处理：无菌条件下从正常分娩足月新生儿胎盘抽取脐带血30～50ml,加入肝素抗凝，以新生儿血清或成人的血清做为预处理的媒介，‑15℃冷藏30分钟；(2)脐血的分离：预处理后的脐带血与Hank's液按体积比例为2:1混合，取一100ml离心管，加入Ficoll‑Paque分离液15～25ml，将脐带血混合液30～50ml缓慢加于分离液上，1800r/min,离心16～20min，离心结束后，离心管中液体分层，吸取白色雾状单个核细胞层到一新100ml离心管中；(3)脐血CD34+细胞的纯化：用红细胞裂解液除去红细胞，再用PBS清洗单核细胞2～3次，计数，按1×10⁷个细胞/ml的密度接种到含培养基Ⅰ的75cm²培养瓶中；使用磁性细胞分选仪和CD34+细胞分选试剂盒分离和纯化CD34+细胞；(4)脐血CD34+细胞体外扩增培养：脐血CD34+细胞重悬于培养基Ⅱ中，按1×10⁶/ml接种于6孔板中，每孔2.5ml,在37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养4周，每周半量换液一次；(5)测定CD34+扩増的细胞的造血祖细胞集落(CFC)形成能力：吸取足量的培养基Ⅲ到注射器中，并分装到灭菌试管中,按1:10(v/v)的比例将细胞添加到培养基Ⅲ中,扭紧试管盖,振摇试管，以保证所有的成份充分混匀,用IMDM+2％FBS稀释至合适浓度,在6孔培养板中每孔接种2×10³个细胞，37℃，5％C〇₂和饱和湿度条件下培养培养2周，在倒置显微镜下直接计数。