[发明专利]一种抗菌脂肽[△C1]Plipastatin及其产生菌和应用

摘要

本发明公开了一种新型抗菌脂肽[△C1]Plipastatin及其产生菌和应用。本发明利用枯草芽孢杆菌PB2‑LC1生产的抗菌物质[△C1]Plipastatin：来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)PB2‑LC1，是一系列线性抗菌脂肽类化合物的总称，共有7种组分，经过LC‑FTICR‑MS鉴定分子量，分别为：980、994、1008、1022、1036、1050和1064Da。该抗菌脂肽类化合物对大肠杆菌、藤黄微球菌、点青霉和桃软腐病菌都有抑制作用，能够防治多种植物病害。

主权项

1.一株产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌PB2‑LC1，其特征在于该菌株通过以下步骤构建得到：(1)PMD‑19T‑△C1重组质粒构建：以保藏编号为CGMCC NO.11723的枯草芽孢杆菌PB2‑L基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.2所示的5′ppsC‑D‑△C1(ClaI)‑F和SEQ ID NO.3所示的3′ppsC‑D‑△C1–SOE‑R为引物进行Plipastatin C和D亚基基因上游同源臂PCR扩增；以SEQ ID NO.4所示的5′ppsC‑D‑△C1–SOE‑F和SEQ ID NO.5所示的3′ppsC‑D‑△C1(KpnI)‑R为引物进行Plipastatin C和D亚基基因下游同源臂PCR扩增；取等摩尔体积的上游和下游同源臂扩增产物作为模板进行PCR扩增，所用的正向引物和反向引物分别为：SEQ ID NO.2所示的5′ppsC‑D‑△C1(ClaI)‑F和SEQ ID NO.5所示的3′ppsC‑D‑△C1(KpnI)‑R获得融合的Plipastatin C和D亚基基因上游和下游同源臂片段；将上述获得的融合的Plipastatin C和D亚基基因上游和下游同源臂片段与PMD‑19T载体链接，连接产物转化Escherichia coli DH5α，挑取单菌落，接种于含终浓度为100mg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，菌液经PCR扩增，筛选阳性克隆，进行重组质粒的双酶切鉴定，以及测序，得到含有Plipastatin C和D亚基基因上游和下游同源臂的PMD‑19T‑△C1质粒；(2)将温敏型质粒pKS2和PMD‑19T‑△C1质粒分别用ClaI和KpnI双酶切，连接pKS2酶切后的大片段和PMD‑19T‑△C1质粒酶切后的小片段，连接产物转化Escherichia coli DH5α，得到阳性转化子，成功构建融合质粒pKS2‑△C1；(3)将构建好的融合质粒pKS2‑△C1转化保藏编号为CGMCC NO.11723的枯草芽孢杆菌PB2‑L菌株，以SEQ ID NO.6所示的5′PKS‑1058‑ERM‑F和SEQ ID NO.75′PKS‑1058‑ERM‑R为引物PCR扩增，验证得到的阳性转化子，通过同源重组的方法整合到枯草芽孢杆菌PB2‑L菌株的基因组上获得产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌PB2‑LC1。