[发明专利]一种矮生沿阶草r射线同质突变体库快速创制方法

摘要

本发明公开了一种矮生沿阶草r射线同质突变体库快速创制方法，包括如下步骤：1)高频体细胞胚外植体材料准备；2)早期体细胞胚外植体的培养；3)物理诱变剂准备；4)早期体细胞胚外植体的γ射线处理；5)体细胞胚分化培养；6)同质突变胚状体快繁増殖培养；7)同质突变胚状体的筛选及快繁増殖培养；8)成熟同质突变胚状体再生植株；9）同质突变体再生植株炼苗移栽；10)田间突变体库建立。本发明快速构建矮生沿阶草r射线饱和同质突变体库的方法，不但为沿阶草功能基因组学、遗传育种问题的深入研究奠定了基础，同时为选育抗寒性强的矮生沿阶草新品种提供最直接有效的同质突变体材料，具有重要的理论意义和应用价值。

主权项

1.一种矮生沿阶草γ射线同质突变体库快速创制方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1) 高频体细胞胚外植体材料准备：选取室外健康无病虫害的矮生沿阶草植株，取其幼嫩茎叶，无菌消毒后在无菌培养基中组培成无菌试管苗，取其茎叶基部0.5‑1.0cm大小外植体，放在体胚发生诱导培养基上暗培养50‑60d，中间继代一次，将产生的初生胚状体转入高频体细胞胚培养基上光下培养50‑60d，中间继代一次，就会持续不断地大量产生球形胚、鱼雷胚和子叶胚发育时期的体细胞胚，将子叶胚转入无激素的成苗培养基培养，20‑25天后形成完整再生植株，以再生植株作为高频体细胞胚外植体材料来源；所述无菌培养基为1/2MS + 2.0 mg/L BA+ 0.5 mg/L NAA +20g/L蔗糖+0.7% 琼脂，所述体胚发生诱导培养基为MS+BA0.2 mg/L+ NAA0.5 mg/L+2，4‑D0.5 mg /L+蔗糖30g/ L +3.5g/L phytagel；所述高频体细胞胚培养基为MS +BA 2mg/L+ NAA 0.5mg/L +蔗糖40g/L +3.5g/L phytagel；成苗培养基为MS+白糖30g/ L +0.7%琼脂；2)早期体细胞胚外植体的培养：将上述具高频体细胞胚再生能力的外植体切取其叶、茎基部0.5cm大小组织块，放在体胚发生诱导培养基上25‑28℃无菌室暗培养7‑10d，此时大部分体细胞为单细胞时期，称作早期体细胞胚，以此作为诱变剂处理材料；所述体胚发生诱导培养基为MS+BA0.2 mg/L+ NAA0.5 mg/L+2，4‑D0.5 mg /L+蔗糖30g/ L +3.5g/L phytagel；3) 物理诱变剂准备：包括⁶⁰Co‑γ射线源准备及辐射剂量的设置；4) 早期体细胞胚外植体的γ射线处理：将早期体细胞胚外植体分成8组，用于8个不同辐射剂量的处理；辐射剂量设置：设置为0.0、5Gy、10Gy、15Gy、20Gy、25Gy 、30Gy、 35Gy 8个不同处理；5) 体细胞胚分化培养：将经γ射线诱变处理过的早期体细胞胚外植体，重新放回无菌室在温度25‑28℃下暗培养50‑60d，中间继代一次，有利于体细胞胚分化，能够见到外植体上大大小小生长发育出几十个早期突变胚状体；6) 同质突变胚状体快繁增殖培养：将上述早期突变胚状体切成0.5cm大小块，分别编号转接于体细胞胚快繁增殖培养基，放在25‑28℃光下培养50‑60d，中间继代一次，可获得大量成熟的同质突变胚状体；体细胞胚快繁增殖培养基为MS + 2mg/L BA + 0.2mg/L NAA +40g/L蔗糖+3.5g/L phytagel，光照强度为1500‑2000lx，光照时间为每天10‑14小时；7) 同质突变胚状体的筛选及快繁増殖培养：将上述快繁的各类同质突变胚状体取出一部分，切成0.5cm大小块，分别编号继续转接于体细胞胚快繁增殖培养基，放入5‑8℃低温无菌培养箱中弱光下500‑800lx培养25‑30d，之后再继代转入25‑28℃光下1500‑2000lx培养25‑30d，获得抗冷性较强的成熟同质突变胚状体；8) 成熟同质突变胚状体再生植株：将上述快繁增殖的具丰富变异的成熟突变胚状体及抗冷性强的成熟突变胚状体均分别编号转接于植株再生培养基中，在无菌室温度25‑28℃光下培养20‑25d，获得具根、茎、叶完整的同质突变体再生植株；所述植株再生培养基为1/2 MS+20g/ L白糖+ 0.7%琼脂；9）同质突变体再生植株炼苗移栽：当根长生长到1‑1.5cm时，将各突变体株系分别编号移栽到花盆，选择轻型基质，放置在温室大棚内，自动间歇喷雾装置浇水；10) 田间突变体库建立：60d后选择温暖湿润阴天将各个突变体株系移栽到室外林下或田间区试圃，分别编号，记载相关性状，在同质突变体生长发育的各阶段进行突变体鉴定、筛选，以此建立起沿阶草γ射线饱和同质突变体库。