[发明专利]一种利用骨架蛋白Fn3在大肠杆菌体内建立N-糖基化受体蛋白模型的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，涉及一种人源Fn3蛋白携带N‑糖基化识别位点作为受体蛋白在大肠杆菌体内建立高效的N‑糖基化受体蛋白模型的方法。该方法包括以下步骤：构建Fn3‑Gly重组蛋白基因表达载体，形成Fn3携带N‑糖基化识别位点的重组基因，将该基因克隆到能将重组蛋白分泌到质周腔的表达载体上，该载体表达的重组蛋白可作为研究原核生物N‑糖基化受体蛋白模型，用于N‑糖基重组研究。本发明可获得热稳定性好、表达量高、便于分离纯化的近100％N‑糖基化重组蛋白质，为N‑糖基重组工程提供良好的蛋白受体、为原核生物N‑糖基重组工程提供受体蛋白模型，为高效地进行N‑糖基重组工程后期寡糖链分析和功能研究奠定基础。

主权项

基于人源骨架蛋白Fn3突变为重组N‑糖基化蛋白质受体方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、Fn3‑Gly重组蛋白基因表达载体构建：1)在Fn3蛋白基因的3′端通过编码柔链GGGGS序列引入编码N‑糖基化识别序列DQNAT碱基序列；2)根据大肠杆菌密码子偏好性在编码N‑糖基化识别序列DQNAT碱基序列下游，通过编码柔链GGGGS序列引入编码6个组氨酸残基碱基序列，用于重组蛋白分离纯化；3)将以上编码Fn3‑Gly重组基因构建到大肠杆菌质周腔表达载体pIG6H上，获得的表达载体命名为pIG6H‑Fn3‑Gly，与携带来源空肠弯曲菌的N‑糖基化基因簇载体的pACYCpgl载体，在大肠杆菌质周腔内共同表达，该载体携带的基因簇可合成寡糖，并将寡糖N‑糖基化在周质间腔表达的携带糖基化识别序列的重组蛋白，其寡糖分子组成为GalNAc‑α1,4‑GalNAc–α1,4‑(Glc–β1,3‑)GalNAc‑α1,4‑GalNAc–α1,4‑GalNAc‑α1,3‑Bac‑β1；(2)、将构建的重组蛋白基因表达载体及携带糖基化基因簇载体pACYCpgl用电击法共同转化到大肠杆菌工程菌株CLM37，含有100微克每毫升的氨苄青霉素和37微克每毫升的氯霉素的LB固体培养基平板上，每升LB固体培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克和15克琼脂粉，过夜12小时培养；筛选出单克隆后将其接种到含有100微克每毫升的氨苄青霉素和37微克每毫升的氯霉素的LB液体培养基，过夜16小时培养，次日，以1:100接种到10毫升含有100微克每毫升的氨苄青霉素和37微克每毫升的氯霉素的LB液体培养基的50毫升的试管中，在25℃条件下，在培养摇床中进行200rpm震动培养，直至细菌浓度OD₆₀₀达到0.4‑0.6，加入1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达重组蛋白Fn3‑Gly，该重组蛋白将在信号肽引导下进入质周腔，该蛋白即为N‑糖基化修饰受体蛋白模型。(3)收集菌体裂解后经Western Blot法检测糖基化效率；收集菌体提取可溶蛋白，用亲和层析方法，分离纯化重组蛋白，该蛋白即为包含有N‑糖基修饰的重组Fn3‑Gly蛋白。