[发明专利]一种浴场海水中致病性细菌的基因芯片检测方法

摘要

本发明属于环境检测技术领域，涉及一种浴场海水中致病性细菌的基因芯片检测方法，用于同时检测浴场海水中主要的致病性细菌。本发明是根据其特异性靶基因设计特异性的引物和探针，通过荧光标记PCR产物，制备氨基芯片，杂交，清洗、扫描等步骤实现对致病性细菌高通量、快速检测的目的，此外，还对其探针浓度、Cy3随机引物浓度、芯片紫外交联时间进行了优化。本发明可在短时间内全面掌握海水浴场的环境现状与变化趋势，可以实现浴场海水中致病性细菌的灵敏、准确、高效检测。

主权项

一种浴场海水中致病性细菌的基因芯片检测方法，其特征在于，该检测方法的步骤为：第一步：致病性细菌及其靶基因的确定，确立浴场海水中常见的6种致病性细菌，分别为嗜水气单胞菌、大肠杆菌O157:H7、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌，其靶基因分别为：嗜水气单胞菌的AhaI基因、大肠杆菌O157：H7的hlyA、fliC、rfbE基因、肠炎沙门氏菌的invA和hilA基因、单增李斯特菌的plc和hlyA基因、溶藻弧菌的hsp60基因、金黄色葡萄球菌的tuf基因；第二步：6种浴场致病性细菌长度为70‑mer寡核苷酸探针及引物的设计，应用AlleleID 6.0软件设计特异基因的引物及寡核苷酸探针；第三步：荧光标记PCR产物，PCR扩增采用20μL反应体系：1)取5μL PCR产物至无菌洁净的0.2mL离心管中，作为模板；2)向每个样品管加入一定浓度的带有荧光素Cy3标记的随机引物(9N)液3μL，并补水至19μL，震荡混匀，瞬时离心；3)将离心后的样品管放入PCR仪，95℃变性3min，立即放置冰上3min；4)在冰上制备荧光标记反应体系Mix：5×Klenow Buffer 2.5μL，klenow酶1μL，dNTP(2.5mM)2.5μL；5)将步骤3)样品管瞬时离心，并向各管中加入6μL荧光标记反应体系Mix，震荡混匀，瞬时离心；6)将离心管放入PCR仪，进行荧光标记扩增，荧光标记反应程序为：37℃1.5h，70℃10min；7)程序结束后，将样品置于冰上，然后进行芯片杂交；第四步：制备基因芯片，采用喷点式芯片点样系统点样仪，以及Nano‑tip A070‑401点样针进行点样；将一定浓度的探针与点样液等体积混合，然后用移液枪将其混合物加入384孔板，按照设定好的参数将探针点到氨基化玻片上，每个点重复三次，点样时要注意保持湿度为70％，点样时除放芯片之外，还要放一张感应试纸，点样完毕后，将点好的芯片取出，关闭仪器，将点制好的芯片放入紫外灯下交联一定的时间，然后用0.5％的SDS冲洗2min，用离心机甩干后，放入4℃冰箱避光保存备用；第五步：杂交，将杂交buffer放到50℃水浴锅中预热，然后配置20μL的杂交液：4×杂交缓冲液  5μL，荧光标记产物  15μL杂交液配好后，95℃变性3min，立即放置冰上，然后放入沸水中煮沸2min后，立即放入预冷的无水乙醇中1min，用低速离心机将芯片甩，然后将该芯片对应的感应试纸放于芯片下面，按照感应试纸上矩阵的排列方式，避光条件下，用移液枪取15μL的荧光标记产物和5μL的阳控混合均匀后加入芯片点样区，然后盖上盖玻片，然后将此芯片放入65℃水浴锅中水浴2h；第六步：芯片清洗及扫描。取出上一步的芯片，用自来水冲洗半分钟，再用蒸馏水冲洗一次，然后分别用42℃预热过的洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，分别洗脱2min，洗液Ⅰ是用10mL 20×SSC(175.3g氯化钠，88.2g柠檬酸钠，加蒸馏水定容至1000mL，pH为7.0)和4mL 10×SDS(10g二十烷基磺酸钠加入双蒸水100mL制成)加入186mL蒸馏水混匀制成；洗液Ⅱ是用2mL20×SSC加入198mL蒸馏水混匀制成；洗液Ⅲ是用1mL 20×SSC加入199mL蒸馏水混匀制成，洗脱完毕后，将芯片离心甩干，用生物芯片扫描仪扫描芯片，并输出荧光值，然后用软件分析所得数据。