[发明专利]一种重组人骨形态发生蛋白-2的循环层析复性方法

摘要

本发明公开了一种重组人骨形态发生蛋白‑2的循环层析复性方法。本发明提供了一种重组人骨形态发生蛋白‑2的复性方法，包括如下步骤：1)变性重组人骨形态发生蛋白‑2包涵体，得到变性后蛋白；2)将所述变性后蛋白进行亲和层析复性，收集洗脱液，得到复性后重组人骨形态发生蛋白‑2二聚体；所述重组人骨形态发生蛋白‑2氨基酸序列为序列表中序列2。本发明的实验证明，本发明的方法复性rhBMP‑2蛋白，蛋白浓度高，试剂消耗少，复性率达70％以上，本发明方法适于工业规模化生产；同时也为同类重组蛋白药物的研发生产提供参考。

主权项

1.一种重组人骨形态发生蛋白‑2包涵体的复性方法，包括如下步骤：1）变性重组人骨形态发生蛋白‑2包涵体，得到变性后蛋白；2）对所述变性后蛋白进行亲和层析复性，依次收集洗脱液，得到回收后层析复性液、重组人骨形态发生蛋白‑2单体、重组人骨形态发生蛋白‑2二聚体和重组人骨形态发生蛋白‑2多聚体；3）变性所述重组人骨形态发生蛋白‑2多聚体，得到重组人骨形态发生蛋白‑2多聚体变性后蛋白；4）对所述重组人骨形态发生蛋白‑2多聚体变性后蛋白和所述重组人骨形态发生蛋白‑2单体进行再次亲和层析复性，收集洗脱液，得到循环层析复性的重组人骨形态发生蛋白‑2二聚体；5）合并步骤2）得到的所述重组人骨形态发生蛋白‑2二聚体和步骤4）得到的循环层析复性的重组人骨形态发生蛋白‑2二聚体，实现重组人骨形态发生蛋白‑2包涵体的复性；在步骤1）和步骤2）之间，还包括预纯化的步骤：将所述变性后蛋白经阳离子交换层析纯化，收集洗脱缓冲液，得到预纯化后变性蛋白；步骤2）包括如下步骤：2）‑1，将所述变性后蛋白上样到亲和层析柱，得到上样后亲和层析柱，再用层析复性液流经所述上样后亲和层析柱，静置复性；所述层析复性液由终浓度为0.1mol/L Tris‑HCl、终浓度为0.5mol/L尿素、终浓度为0.1mol/L 2‑环己氨基乙磺酸、终浓度为0.2mol/L 精氨酸、终浓度为0.5mmol/L 氧化型谷胱甘肽、终浓度为1mmol/L 还原型谷胱甘肽和水组成；2）‑2，用洗脱缓冲液A对2）‑1处理后的层析柱进行洗脱，收集洗脱液，得到回收后层析复性液；所述洗脱缓冲液A为洗脱缓冲液FH‑A；2）‑3，用洗脱缓冲液B对2）‑2处理后的层析柱进行洗脱，收集洗脱液，得到重组人骨形态发生蛋白‑2单体；所述洗脱缓冲液B为由体积分数75%的平衡缓冲液FH‑A 和体积分数25%的洗脱缓冲液FH‑B‑1组成的混合液；2）‑4，用洗脱缓冲液C对2）‑3处理后的层析柱进行洗脱，收集洗脱液，得到重组人骨形态发生蛋白‑2二聚体；所述洗脱缓冲液C为由体积分数55%平衡缓冲液FH‑A和体积分数为45%的洗脱缓冲液FH‑B‑2组成的混合液；2）‑5，用洗脱缓冲液D对2）‑4处理后的层析柱进行洗脱，收集洗脱液，得到重组人骨形态发生蛋白‑2多聚体；所述洗脱缓冲液D为洗脱缓冲液FH‑B‑3；所述洗脱缓冲液FH‑A由终浓度为50mmol/L Tris‑HCl、终浓度为3mol/L尿素和水组成；所述洗脱缓冲液FH‑B‑3由终浓度为50mmol/L Tris‑HCl、终浓度为3mol/L尿素、终浓度为1 mol/L NaCl和水组成；所述洗脱缓冲液FH‑B‑2为将所述洗脱缓冲液FH‑B‑3中的NaCl终浓度调节为0.45mol/L得到的溶液；所述洗脱缓冲液FH‑B‑1为将所述洗脱缓冲液FH‑B‑3中的NaCl终浓度调节为0.25mol/L得到的溶液；所述2）‑2，所述收集洗脱液为收集0.8个柱体积的洗脱液；所述洗脱的时间为25分钟所述2）‑3，所述收集洗脱液为收集3个柱体积的洗脱液；所述洗脱的时间为70分钟，所述2）‑4，所述收集洗脱液为收集1.5个柱体积的洗脱液；所述洗脱的时间为38分钟，所述2）‑5，所述收集洗脱液为收集1.5个柱体积的洗脱液；所述洗脱的时间为25分钟；步骤4）包括如下步骤：4）‑1，将所述重组人骨形态发生蛋白‑2多聚体变性后蛋白和所述重组人骨形态发生蛋白‑2单体上样亲和层析柱，得到上样后亲和层析柱，再将所述回收层析复性液流经所述上样后层析柱，静置复性；4）‑2，用所述洗脱缓冲液B洗涤4）‑1处理后的层析柱；所述洗涤流速为80±20ml/min；4）‑3，用所述洗脱缓冲液C洗脱4）‑2处理后的层析柱，收集洗脱液，得到循环层析复性的重组人骨形态发生蛋白‑2二聚体；4）‑3中，所述收集洗脱液为收集0.8个柱体积的洗脱液，所述洗脱的时间为20分钟；所述阳离子交换层析的层析介质为SPSepharose；所述亲和层析的层析介质为Heparin Sepharose；所述重组人骨形态发生蛋白‑2的氨基酸序列为序列2。