[发明专利]一种连续化生产c-di-AMP的方法有效
| 申请号： | 201510281173.X | 申请日： | 2015-05-28 |
| 公开（公告）号： | CN104946705B | 公开（公告）日： | 2019-04-16 |
| 发明（设计）人： | 杨国宇;张改平;杨森;孔江南;张超;韩莹倩;郭豫杰 | 申请（专利权）人： | 河南农业大学 |
| 主分类号： | C12P19/28 | 分类号： | C12P19/28;C12N15/62;C12N11/12;C12R1/19 |
| 代理公司： | 郑州联科专利事务所(普通合伙) 41104 | 代理人： | 时立新 |
| 地址： | 450002 河*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | 本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种采用固定化DisA蛋白连续生产c‑di‑AMP的方法。该方法步骤：1、DisA基因改造，通过基因工程手段，将DisA基因与cbm基因融合构建重组质粒载体；2、重组质粒转化，CBM‑DAC融合蛋白的表达；3、一步纯化和固定化DAC酶；4、连续化生产c‑di‑AMP；5、反应产物分离浓缩与纯化。本发明特异性的利用了CBM结构域与纤维素结合但无水解功能的特点，工艺较为成熟，生产成本低廉，环境友好，所制备的DAC酶类型多样，来源广泛，而且浓度、纯度较高，酶促反应效率较高，因而具有较好的开发应用价值。 | ||
| 搜索关键词： | 连续化生产 固定化 构建重组质粒载体 反应产物分离 基因工程手段 重组质粒转化 酶工程技术 环境友好 基因工程 基因融合 开发应用 酶促反应 融合蛋白 一步纯化 纤维素 结构域 水解 制备 生产成本 蛋白 浓缩 成熟 改造 | ||
【主权项】：
1.一种连续生产c‑di‑AMP的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）DisA基因改造，通过基因工程手段，将DisA基因与cbm基因融合构建重组质粒载体；所述基因工程手段，PCR扩增DisA基因时，引物序列设计如下：F 引物：CCGCTCGAGATGGAAAAAGAGAAAAAAGGGGCGAAACAC；R 引物：CGCGGATCCTCACAGTTGTCTGTCTAAATAATGCTTCTCTTG；PCR扩增时，以枯草芽孢杆菌基因组DNA作为模板；所述模板枯草芽孢杆菌基因组DNA来源于菌株Bacillus subtilis subsp. subtilis str. BSP1，所述Bacillus subtilis subsp. subtilis str. BSP1菌株的全基因组编号为GenBank: CP003695.1；所述cbm基因序列采用pCG质粒中cbm基因片段；（2）重组质粒转化，CBM‑DAC融合蛋白的表达；（3）一步纯化和固定化DAC酶；所述固定化DAC酶采用微晶纤维素进行固定化；（4）连续化生产c‑di‑AMP；（5）反应产物分离浓缩与纯化。
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