[发明专利]嗜热细菌海藻糖合酶C端片段提高海藻糖合酶酶活的方法

摘要

本发明公开了嗜热细菌海藻糖合酶C端片段提高海藻糖合酶酶活的方法。本发明运用分子生物学技术在表达恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌来源的海藻糖合酶的同时，将这四种不同来源的海藻糖合酶的C端连接嗜热细菌来源海藻糖合酶C端基因片段在大肠杆菌中融合表达。在嗜热细菌来源海藻糖合酶C端基因片段的作用下，提高了海藻糖合酶催化活性。本发明将改造后的海藻糖合酶和在大肠杆菌中表达，提高了海藻糖合酶的酶活。

主权项

嗜热细菌海藻糖合酶C端片段提高海藻糖合酶酶活的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)嗜热细菌海藻糖合酶基因编码区的克隆及其在大肠杆菌中的表达将恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌总DNA根据已知的海藻糖合酶基因编码区序列，设计一对上下游引物，设计的引物为：恶臭假单胞菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22treSBamHF:5’‑GGGAAAGGATCCGGCCAAGCGTTCCCGCC‑3’，下划线为BamHI酶切位点，下游引物22treSXhoR:5’‑GGGAAACTCGAGTGACTCTCCCCAGGTACTGATC‑3’，下划线为XhoI酶切位点；谷氨酸棒杆菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22cgtreSNcoF：5’‑GGGAAACCATGGGCACTGATACCTCTCCGTTGAATTCTCA‑3’，下划线为NcoI酶切位点，下游引物：22cgtreSHindR：5；‑GGGAAAAAGCTTTTCCATATCGTCCTTTTCATCGGC‑3’，下划线为HindIII酶切位点；天蓝色链霉菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22sctreSBamHF：5’‑GGGAAAGGATCCGCACCGTCAACGAGCCCGTAC‑3’，下划线为BamHI酶切位点，下游引物22sctreSHindR：5’‑GGGAAAAAGCTTAGCGCGGCGGCCG‑3’，下划线为HindIII酶切位点；海栖热袍菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22tmtreSEcoRF：5’‑GGGAAAGAATTCGGATGTTGTGTTGAGAGAGCGAAGC‑3’，下划线为EcoRI酶切位点，下游引物22tmtreSSalR：5’‑GGGAAAGTCGACCCTCAACAGATCTAAGAAGAGTTTCAGATAGTT‑3’，下划线为BamHI酶切位点；PCR反应体系为50μL：基因组模板DNA 1μL，上下游引物各2μL，dNTP Mix 3μL，2×PrimeSTAR GC Buffering 25μL，DMSO 0.75μL，ddH2O 15.65μL，PrimeSTAR 0.6μL；PCR反应条件为98℃预变性1min，进行98℃12s，65℃10s，72℃x s，共9个循环，然后进行98℃12s，57℃30s，72℃x s，共21个循环，最后72℃延伸3min；x根据片段长度设定1min延伸1000bp；切胶回收PCR产物并将其克隆至pET‑22b上；对所获得的海藻糖合酶进行测序，构建pET‑22b‑pptreS、pET‑22b‑cgtreS、pET‑22b‑sctreS和pET‑22b‑tmtreS质粒并实现其在大肠杆菌中的表达；(2)恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌来源的海藻糖合酶与其融合连接的嗜热细菌海藻糖合酶C端嗜热片段基因编码区的克隆及pET‑22b‑pptreS565‑tttreSC、pET‑22b‑cgtreS‑tttreSC、pET‑22b‑sctreS‑tttreSC和pET‑22b‑tmtreS‑tttreSC重组质粒的构建；根据已知的嗜热细菌来源的海藻糖合酶基因C端嗜热片段编码区序列和恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌四种来源的海藻糖合酶基因编码区序列，分别设计一对上下游引物，设计的引物为：恶臭假单胞菌来源的去掉其C端后的1696bp，并与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端1239bp基因融合表达的海藻糖合酶基因片段的上游引物EchouABamHF：5’‑GGGAAAGGATCCGGCCAAGCGTTCCCGCCCGGCAGCC‑3’，下划线为BamHI酶切位点，下游引物EchouAlinkerR：5’‑GGCGGCGGCTCCGGCTCCGGGCATGCGGTCATGG‑3’；嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端的1239bp，并与恶臭假单胞菌来源的去掉其C端后的1696bp的海藻糖合酶基因片段融合表达的海藻糖合酶C端基因片段的上游引物EchouBlinkerF：5’‑GGAGCCGGAGCCGCCGCCTGGGCCGAGGAGCCCG‑3’，下游引物EchouBHindR：5’‑GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT‑3’，下划线为HindIII酶切位点；谷氨酸棒杆菌来源的，并与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端1239bp基因融合表达的海藻糖合酶基因片段的上游引物GuansuanANcoF：5’‑GGGAAACCATGGGACTGATACCTCTCCGTTGAATTCTCAGCCG‑3’，下划线为NcoI酶切位点，下游引物GuansuanAlinkerR：5’‑GGCGGCGGCTCCGGCTCCTTCCATATCGTCCTTT‑3’；嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端的1239bp，并与谷氨酸棒杆菌来源的海藻糖合酶基因片段融合表达的海藻糖合酶C端基因片段的上游引物GuansuanBlinkerF：5’‑GGAGCCGGAGCCGCCGCCTGGGCCGAGGAGCCCG‑3’，下游引物GuansuanBHindR：5’‑GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT‑3’，下划线为HindIII酶切位点；天蓝色链霉菌来源的，并与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端1239bp基因融合表达的海藻糖合酶基因片段的上游引物TianlanseABamHF：5’‑GGGAAAGGATCCGACCGTCAACGAGCCCGTACCTGACACCTTCGAG‑3’，下划线为BamHI酶切位点，下游引物TianlanseAlinkerR：5’‑GGCGGCGGCTCCGGCTCCAGCGCGGCGGCCGATG‑3’；嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端的1239bp，并与天蓝色链霉菌来源的海藻糖合酶基因片段融合表达的海藻糖合酶C端基因片段的上游引物TianlanseBlinkerF：5’‑GGAGCCGGAGCCGCCGCCTGGGCCGAGGAGCCCG‑3’，下游引物TianlanseBHindR：5’‑GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT‑3’，下划线为HindIII酶切位点；海栖热袍菌来源的，并与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端1239bp基因融合表达的海藻糖合酶基因片段的上游引物HaixiABamHF：5’‑GGGAAAGGATCCGGATGTTGTGTTGAGAGAGCGAAGCATAGAGG‑3’，下划线为BamHI酶切位点，下游引物HaixiAlinkerR：5’‑GGCGGCGGCTCCGGCTCCCCTCAACAGATCTAAG‑3’；嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端的1239bp，并与海栖热袍菌来源的海藻糖合酶基因片段融合表达的海藻糖合酶C端基因片段的上游引物HaixiBlinkerF：5’‑GGAGCCGGAGCCGCCGCCTGGGCCGAGGAGCCCGCCCCCGAG‑3’，下游引物HaixiBHindR：5’‑GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT‑3’，下划线为HindIII酶切位点；PCR反应体系为50μL：基因组模板DNA 1μL，上下游引物各2μL，dNTP Mix 3μL，2×PrimeSTAR GC Buffering 25μL，DMSO 0.75μL，ddH2O 15.65μL，PrimeSTAR 0.6μL；带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的恶臭假单胞菌来源海藻糖合酶基因片段的上游引物EchouABamHF：5’‑GGGAAAGGATCCGGCCAAGCGTTCCCGCCCGGCAGCC‑3’，下划线为BamHI酶切位点，下游引物EchouBHindR：5’‑GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT‑3’，下划线为HindIII酶切位点；带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的谷氨酸棒杆菌来源海藻糖合酶基因片段的上游引物GuansuanANcoF：5’‑GGGAAACCATGGGACTGATACCTCTCCGTTGAATTCTCAGCCG‑3’，下划线为NcoI酶切位点，下游引物GuansuanBHindR：5’‑GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT‑3’，下划线为HindIII酶切位点；带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的天蓝色链霉菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物TianlanseABamHF：5’‑GGGAAAGGATCCGACCGTCAACGAGCCCGTACCTGACACCTTCGAG‑3’，下划线为BamHI酶切位点，下游引物TianlanseBHindR：5’‑GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT‑3’，下划线为HindIII酶切位点；带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的海栖热袍菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物HaixiABamHF：5’‑GGGAAAGGATCCGGATGTTGTGTTGAGAGAGCGAAGCATAGAGG‑3’，下划线为BamHI酶切位点，下游引物HaixiBHindR：5’‑GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT‑3’，下划线为HindIII酶切位点；PCR反应体系为50μL：四种来源的海藻糖合酶基因片段DNA 1μL，嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端基因片段1μL，上下游引物各2μL，dNTP Mix 3μL，2×PrimeSTAR GC Buffering 25μL，DMSO 0.75μL，ddH2O 14.65μL，PrimeSTAR 0.6μL；PCR反应条件为98℃预变性1min，进行98℃12s，72℃10s，72℃x s，共9个循环，然后进行98℃12s，72℃30s，72℃x s，共21个循环，最后72℃延伸3min，x根据片段长度设定1min延伸1000bp；切胶回收PCR产物并将其克隆至pET‑22b上；对所获得的海藻糖合酶进行测序，构建pET‑22b‑pptreS565‑tttreSC、pET‑22b‑cgtreS‑tttreSC、pET‑22b‑sctreS‑tttreSC和pET‑22b‑tmtreS‑tttreSC质粒并实现其在大肠杆菌中的表达；(3)恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌来源的海藻糖合酶与其融合连接的嗜热细菌海藻糖合酶C端嗜热片段在大肠杆菌中诱导表达海藻糖合酶分别将pET‑22b‑pptreS565‑tttreSC、pET‑22b‑cgtreS‑tttreSC、pET‑22b‑sctreS‑tttreSC和pET‑22b‑tmtreS‑tttreSC重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta，DE3，中，诱导表达海藻糖合酶。