[发明专利]用于鉴定罕见切割工程化双链断裂诱导剂的变体识别位点的方法及其组合物和用途

摘要

本发明提供了用于鉴定罕见切割工程化双链断裂诱导剂的变体识别位点的方法及其组合物。本发明还提供了具有所述变体识别位点的核酸构建体、酵母、植物、植物细胞、外植体、种子和谷物。本发明提供了鉴定罕见切割工程化双链断裂诱导剂的具有提高的底物活性的变体识别位点的方法。

主权项

1.一种用于鉴定罕见切割工程化双链断裂诱导剂的变体识别位点的体外方法，所述双链断裂诱导剂能够在预期识别位点中引入罕见双链断裂，所述方法包括：a. 使分离的基因组DNA与能够向所述基因组DNA中引入双链断裂的罕见切割工程化双链断裂诱导剂接触，其中所述双链断裂产生核苷酸悬端，或其中将一个或多个核苷酸添加至所述双链断裂以生成核苷酸悬端；b. 将第一接头连接到所述核苷酸悬端，其中所述接头包含至少一个核苷酸的悬端，所述悬端与步骤a中的双链断裂的核苷酸悬端互补；c. 剪切步骤（b）中获得的连接的DNA并将至少一个第二接头连接到经剪切的核苷酸末端以允许所述双链断裂周围的基因组DNA片段的扩增和测序；d. 将（c）中获得的DNA片段的核苷酸序列与参考基因组DNA序列进行比对；以及e. 鉴定在与所述工程化双链断裂诱导剂的预期识别位点比较时包含至少一个核苷酸碱基改变的变体识别位点；其中所述双链断裂诱导剂选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、TAL效应物核酸酶、转座酶、Cas内切核酸酶和位点特异性重组酶。