[发明专利]一种邻位连接技术检测NGAL的方法

摘要

本发明提出了一种邻位连接技术检测NGAL的方法，将复杂的蛋白检测转换成对DNA的检测，并通过qPCR扩增的方法将信号放大，可以检测在体内低表达的蛋白质。我们的实验结果也表明，邻位连接技术具有灵敏、特异、快速、灵活、高通量和多功能等特点，能够检测到较低浓度的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。本发明将科技前沿的新型蛋白检测技术---邻位连接技术与亟待解决的NGAL指标相结合，为NGAL低成本高灵敏度的检测提供新的方法，可以应用于医学和生物学等众多领域。

主权项

一种邻位连接技术检测NGAL的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1）将单链DNA Arm1和Arm2偶联到NGAL蛋白质的多克隆抗体上，形成探针，具体流程为：将DBCO与NGAL蛋白质的多克隆抗体共孵育25—35分钟，加入与DBCO摩尔比在1:250以上Tris‑HCl室温孵育5—10分钟以终止反应，加入单链DNA Arm1和Arm2在4℃下过夜孵育，使多抗分别偶联两种单链DNA，即得到探针；2）将多克隆抗体与磁珠制成混合溶液，使多克隆抗体固定在磁珠上，然后将NGAL蛋白质加入所述混合溶液中，使多克隆抗体捕获NGAL蛋白质，通过洗涤去除样品中未结合分子；3）将单链DNA PCR forward primer、PCR reverse primer、Connector oligonucleotide、A TaqMan probe和qPCR溶液置入PCR管中，形成PCR反应溶液，所述A TaqMan probe的5`端修饰有FAM荧光基团；将探针加入混合溶液，使探针识别固定在磁珠上的NGAL蛋白质，再洗涤去除剩余的游离探针，然后将其加入所述PCR反应溶液中进行聚合反应，使DNA扩增，产生信号。