[发明专利]结直肠癌干细胞疫苗及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种肿瘤干细胞疫苗及其制备和应用。本发明所述的结直肠癌干细胞疫苗包括：按体积比为3:1:1混合的灭活的结直肠癌干细胞、甘露聚糖肽和脂肪乳。本发明所述的结直肠癌干细胞疫苗的制备方法，包括以下步骤：获得结直肠癌干细胞；将所述结直肠癌干细胞灭活；以及将灭活的结直肠癌干细胞冻融在生理盐水里，与佐剂甘露聚糖肽、脂肪乳混匀，从而获得所述的结直肠癌干细胞疫苗。本发明提供了根据本发明所述的制备方法获得的结直肠癌干细胞疫苗用于制备治疗结直肠癌的药物中的用途。本发明为结直肠癌的治疗及其疫苗的制备提供了一种新的途径，对结直肠癌患者具有积极地治疗效果，可增强患者的免疫功能，对延长患者的生存时间具有积极作用。

主权项

一种结直肠癌干细胞疫苗，其特征在于，组分为：按体积比为3:1:1混合的灭活的结直肠癌干细胞、甘露聚糖肽和脂肪乳；其中，所述的结直肠癌干细胞是CD133阳性结直肠癌干细胞，并按照如下方法制备：（1）获得结直肠癌干细胞：A．将液氮或‑ 80℃保存的结直肠癌细胞于37℃水浴，快速融化；B．用8.0ml的含10%FBS的RPMI1640培养基混匀已融化的结直肠癌细胞悬液，于1500 转/ 分，离心8分钟；C．弃上清，再吸取8.0ml培养基质混匀细胞沉淀，再1500 转/分，离心8分钟，弃上清，细胞沉淀用1.0ml培养基混匀，备用；D．另取一个75cm2 方瓶，加入14.0ml 培养基质，将1.0ml上述制备的含结直肠癌细胞悬液加入此方瓶中，于37℃，5%CO2 孵育箱中培养；E．结直肠癌细胞呈贴壁生长，经过3‑4天，结直肠癌细胞生长至80%‑95%单层时，弃上清，用0.5mM 的EDTA，处理结直肠癌细胞3‑5分钟，同时加入0.25%胰酶1.0 ml以消化肿瘤细胞，用倒置显微镜观察，当 90% 的结直肠癌细胞变圆时，即可用弯管吹打并将消化的细胞转移到15ml离心管中，于1500 转/分下，离心8分钟，弃上清，计数，若细胞数不足，扩增至三个培养瓶，继续消化离心；F．加入缓冲液重悬细胞，采用CD133免疫磁珠分选系统从细胞液中分选出CD133阳性结直肠癌干细胞；G．将前一步骤获得的CD133阳性结直肠癌干细胞在DMEM/F12培养液中进行培养，所述DMEM/F12培养液中添加：生长因子rhEGF 15~25ng/ml、rhbFGF 5~15ng/ml、硫酸肝素2~6ug/ml、质量百分比为0.1~0.2%的胎牛血清和质量百分比为0.5~1.5%的青霉素‑链霉素双抗；H．37℃、5%CO2孵育箱中培养5‑7天，从而获得足够用于制备结直肠癌干细胞疫苗的CD133阳性结直肠癌干细胞，所述足够用于制备结直肠癌干细胞疫苗的CD133阳性结直肠癌干细胞是培养至细胞个数达到1 ×105~5×105/ml的CD133阳性结直肠癌干细胞；（2）将所述结直肠癌干细胞灭活：将结直肠癌干细胞由‑80℃至20℃反复冻融五次致死；以及（3）将灭活的结直肠癌干细胞冻融在生理盐水里，与佐剂甘露聚糖肽、脂肪乳混匀，从而获得所述的结直肠癌干细胞疫苗。