[发明专利]一种临床用间充质干细胞的制备方法

摘要

本发明提供一种临床用间充质干细胞的制备方法，本发明制备方法在脐带采集前对产妇进行筛选，以符合条件的健康足月产妇志愿者作为采集目标，之后进行分离扩增进行规模化培养直至第三代，进行冷冻保存，对分离过程及冷冻过程的的中间品进行一系列质量检测，冷冻后细胞复苏洗涤待用，活率无明显降低。本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级、统一、系统监控，以实现间充质干细胞的临床标准产品。

主权项

一种临床用间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：步骤一、脐带筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带，置于脐带保存液中4℃冷藏，并于24小时内进行分离处理；步骤二、脐带分离：将脐带转移到培养皿中，生理盐水清洗；去除两端结扎部位，剥除脐静脉和两条脐动脉；展平，撕下华通氏胶，去除羊膜；将撕下的华通氏胶置于离心管中剪碎至1～4mm³小块；步骤三、间充质细胞原代培养：将剪碎的华通氏胶转至装有完全培养基的透气盖培养瓶中，在37℃、5％CO₂、饱和湿度环境中培养；细胞密度达约1g/T75瓶，第5天首次换液，此后每3天换液一次，至第14天左右；细胞融合度达80％以上时，用胰蛋白酶消化传代，用原培养上清终止；步骤四、传代培养：传代时，传代细胞接种密度约为6000个/cm²；3天后，细胞密度达80％以上，再次传代；传至第三代，细胞数约为3～5×10⁹，收集细胞并计数和活率，按2×10⁷/ml/管进行冷冻保存；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取1×10⁷细胞做细胞表面标志检测；步骤五、间充质干细胞表面标志、分化检测：按照ISCT间充质干细胞标准检测阳性指标以及阴性指标；对第三代细胞进行分化实验检测干细胞分化能力，分别向成脂、成骨、成软骨三个方向分化，进行油红O染色、茜素红染色和阿尔新蓝染色鉴定；间充质干细胞表面标志、分化检测后，冷冻保存；步骤六、临床用间干细胞使用：取冷冻细胞，复苏后用生理盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。