[发明专利]一种棉花保卫细胞原生质体的分离方法

摘要

本发明具体涉及一种棉花保卫细胞原生质体的分离方法。该方法包括诱导棉花种子萌发、酶解分离保卫细胞原生质体、离心等步骤。本发明所提供的棉花保卫细胞原生质体的分离方法，对棉花叶片的保卫细胞采用一步酶解法，与两步酶解法相比大大缩短了实验时间，简化了实验操作流程，提高了实验效率，而且保持了原生质体较高的生理活力，更解决了棉花保卫细胞原生质体分离的难题。棉花保卫细胞原生质体的成功分离，为研究保卫细胞膜通透性、离子转运以及气孔运动机理提供了较好的实验基础。

主权项

一种棉花保卫细胞原生质体的分离方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）取棉花种子，诱导萌发；（2）取步骤（1）中萌发3~4周后的棉花真叶，漂洗干净，撕取表皮条，将收集的表皮条转入酶解液中，于23~28℃水浴震荡1.5~2h游离保卫细胞原生质体；（3）向步骤（2）中酶解结束后的混合液中加入混合液5~10倍体积的基本介质，滤网双层过滤，滤液低速离心，弃上清液，保留离心管管体下端1/3的溶液，所述低速离心为200~300转/min，离心5~8分钟；（4）将步骤（3）中保留溶液加入基本介质重新悬浮，高速离心，弃上清，所述高速离心为700~800转/min，离心8~10min；重复此步骤2~3次，可获得纯净的原生质体；步骤（2）中所述酶解液体系组成为：纤维素酶RS 1.3wt%、果胶酶Y‑23 0.03wt%、牛血清蛋白BSA 0.25wt%、抗坏血酸 0.5 mmol/L，山梨醇调渗透压至530~550 mOsmol /Kg，1 mmol/ L KOH调节pH至5.0~6.0；步骤（3）、步骤（4）中所述基本介质为液体，其组成为：谷氨酸钾10 mmol/ L、MgCl2 2 mmol/ L、 Mes 10 mmol/ L，山梨醇调渗透压至550~600 mOsmol /Kg，1 mmol/ L KOH调pH至5.0~6.0。