[发明专利]一种用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的DNA提取方法

摘要

本发明公开了一种用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的DNA提取方法，利用物理、化学和酶等多种方法配合对细胞壁进行裂解，使之能够最大限度释放微生物DNA，特别是对革兰氏阳性菌有很好的裂解效果；另外，本发明所用的化学试剂都是实验室常备的，容易获得且价格低廉。使用本发明得到的高通量测序结果能够比较准确地反映瘤胃中微生物的丰度及多样性。

主权项

一种用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的DNA提取方法，包括以下步骤：(1)向0.5‑2g牦牛瘤胃样品中加入10ml4℃样品洗涤液A，涡旋振荡1min，4℃离心机，1000r/min,离心5min，吸取上清液；再次向含有瘤胃内容物的离心管中加入4℃5ml洗涤液A，放置于涡旋震荡仪，振荡1min，吸取上清液；再次向含有瘤胃内容物的离心管中加入4℃5ml洗涤液A，放置于涡旋震荡仪，振荡1min，吸取上清液；所有上清液于4℃，12000r/min离心10min，倒掉离心管上层清液，保留离心管底部的微生物和腐殖质，泥土混合物的沉淀层；(2)微生物沉淀层里边加入60ul裂解缓冲液B，加入3ul蛋白酶K，颠倒混匀，放置于58℃恒温摇床孵育1h；加入100ul NaCl溶液，加入80ul CTAB裂解液65℃水浴10min；加入0.1g直径为0.2mm beads，放置于涡旋振荡仪上进行顺时针和逆时针涡旋交替震荡3min；加入溶菌酶3mg,颠倒混匀，放置于37℃恒温摇床，孵育1h；加入等体积(氯仿：异戊醇＝24:1)，混匀后放于冰上静置，3min,12000r/min抽提蛋白质；吸取上清液置新灭菌离心管中，加入等体积(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)混匀于冰上静置3min；12000r/min抽提蛋白质吸取上清液，置于新的灭菌离心管中，再次加入等体积(氯仿：异戊醇＝24:1)，混匀后放于冰上静置5min；12000r/min离心5min,吸取上清液放置于新的离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，重悬，室温放置5min；12000r/min离心10min，加入1ml70％冰乙醇洗涤；12000r/min离心5min，加入50ul无菌水溶解；加入3ul RNA酶，37℃，静置1h，获得目标纯度DNA溶液。