[发明专利]人神经干细胞体外定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法

摘要

本发明提出一种将人神经干细胞体外定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法，该方法包括人神经干细胞的贴壁培养；多巴胺能神经元前体细胞的诱导；多巴胺能神经元的定向诱导；人神经干细胞和多巴胺能神经元前体细胞的冻存和复苏。通过本发明的步骤，可以在体外获得丰富的多巴胺能神经元，与目前众多多巴胺能神经元生产方式相比，具有成本低廉、安全性高、生产效率高、可操作性强的特点。这一体外多巴胺能神经元生产方式，为多巴胺能神经元临床移植治疗帕金森氏症的应用提供新的思路。

主权项

一种将人神经干细胞体外定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法，其包括如下步骤：步骤1：人神经干细胞的贴壁培养：用无血清培养基将人神经干细胞按照5×104/mL的浓度制成细胞悬液，接种至层粘连蛋白(Laminin)包被的培养器皿中，35℃培养箱中静置培养24‑48小时；步骤2：多巴胺能神经元前体细胞的诱导：换用多巴胺能神经元前体细胞诱导液，此诱导液由无血清培养基添加细胞因子音猥因子(SHH)、成纤维细胞生长因子8b(FGF8b)、糖原合成酶激酶‑3(GSK‑3)抑制剂CHIR99021组成，35℃培养箱中静置培养7‑10天，每3天换液；步骤3：多巴胺能神经元细胞的定向诱导：换用多巴胺能神经元细胞定向诱导液，此诱导液由神经细胞培养基(Neurobasal Medium)添加B27、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、转化生长因子‑β3(TGFβ3)、抗坏血酸(ascorbic acid)、环腺苷酸(cAMP)、佛司可林(forskolin)组成；35℃培养箱中静置培养14‑20天，每3天换液；收获细胞后即得到多巴胺能神经元。