[发明专利]一种用大肠杆菌表达高可溶性蚯蚓纤溶酶的方法

摘要

本发明涉及一种用大肠杆菌表达高可溶性蚯蚓纤溶酶的方法，包括构建基因表达工程菌、培养工程菌、制备细菌裂解物、亲和层析、浓缩和酶切六个步骤。本发明采用基因定点突变、多种表达载体和表达系统进行筛选，获得最佳结果。利用基因重组技术，改造蚯蚓纤溶酶使其与NusA助溶蛋白标签实现重组表达，极大提高了目的蛋白在大肠杆菌中的可溶表达，通过一步亲和层析，获得高产率的纯酶。这种蚯蚓纤溶酶融合蛋白有着稳定的生物学活性，如溶解纤维蛋白，激活某些细胞表面蛋白酶激活受体-2，可在-20℃保存至少3年，去除NusA助溶蛋白标签后，能进一步提高其纤溶酶活性。

主权项

一种用大肠杆菌表达高可溶性蚯蚓纤溶酶的方法，其特征在于改造大肠杆菌表达工程菌，增加蚯蚓纤溶酶在大肠杆菌中大量表达的可溶程度，提高纤溶酶储存稳定性，步骤如下：步骤一构建表达高可溶性蚯蚓纤溶酶的大肠杆菌工程菌在基因数据库检索到蚯蚓纤溶酶基因序列，通过反转录聚合酶链反应从赤子爱胜蚓获得一个完整的基因，进行测序，确认由741个核苷酸组成，编码246氨基酸残基，通过聚合酶链反应给该基因5′端和3′端各添加一个酶切位点，对5个碱基进行定点突变，聚合酶链反应产物进行测序确认后，插入载体的相应位点，得到原核表达载体并测序确认，转化至大肠杆菌中，得到表达工程菌；步骤二表达工程菌培养制备2～10L氨苄青霉素普通培养基，接种工程菌，37℃培养至菌液在600nm处吸光值为0.6～1.0，加入终浓度为0.5～1mM的异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷，18～21℃诱导8～12小时；步骤三制备细菌裂解物菌液以13000转/分钟的速度，离心10分钟，收获沉淀，重新溶解在4℃Tris‑HCl pH＝7.2～7.6缓冲液中，超声裂解细胞，再以13000转/分钟的速度，离心30分钟，收获上清，备用；步骤四亲和层析上清过镍离子螯合亲和层析柱，用Tris‑HCl pH＝7.2～7.6缓冲液洗脱至280nm处吸光值不再下降后，用2个柱体积Tris‑HCl pH＝7.2～7.6缓冲液含50mM咪唑洗脱，再用2个柱体积Tris‑HCl pH＝7.2～7.6缓冲液含100mM咪唑洗脱，接着用2个柱体积Tris‑HCl pH＝7.2～7.6缓冲液含150mM咪唑洗脱，最后用2个柱体积Tris‑HCl pH＝7.2～7.6缓冲液含200mM咪唑洗脱，十二烷基磺酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳检测洗脱产物，选择纯度好的合并，对Tris‑HCl pH＝7.2～7.6缓冲液透析；步骤五浓缩超滤至蛋白浓度为1～3mg/mL左右，‑20℃保存，作为蚯蚓纤溶酶融合蛋白产品；步骤六酶切蚯蚓纤溶酶融合蛋白经肠激酶切割，超滤或镍离子螯合亲和层析柱纯化，去掉融合蛋白，获得重组蚯蚓纤溶酶产品，浓缩至1mg/mL左右，在‑20℃保存。