[发明专利]一种信号放大技术电化学传感器检测DNA的方法

摘要

本发明涉及一种信号放大技术电化学传感器制备方法及应用。首先制备金-铂纳米粒子，并以硫堇为电化学试剂将其固定在金-铂纳米粒子表面，再将探针DNA通过固定在纳米粒子表面，制得电化学探针。同时将发卡DNA自组装在金电极表面得电化学传感器。在电化学传感器上加入目标DNA时，目标DNA与组装在金电极表面表面上的发卡DNA部分互补配对打开发卡结构。然后另外一条发卡DNA链通过竞争作用取代目标链DNA，从而释放目标链DNA。释放的目标链则继续打开电极表面的其他的发卡结构DNA，如此的循环作用实现了目标链DNA的循环使用，结合制备的电化学探针，实现对目标DNA的测定。本发明的传感器具有很高的选择性和检测灵敏度；金-铂纳米粒子为载体负载硫堇为探针具有电化学稳定的优势。

主权项

一种信号放大技术电化学传感器检测DNA的方法，包括以下步骤： (1)电化学探针制备方法其特征在于： (a)取2mL的离心管，加入2～30μL DNA1和2～30μL pH8.2的50mM的Tris‑HCl缓冲溶液和10μL TCEP反应1h，用以活化巯基；然后，另取2mL离心管依次加入1mL金‑铂纳米粒子和100～2000μL硫堇溶液反应0.5h，使硫堇吸附在金‑铂纳米粒子上； (b)将吸附了硫堇的金‑铂纳米粒子加入到活化好的巯基DNA1中，放入摇床轻摇反应16h，使巯基DNA1与金‑铂纳米粒子连接起来；最后在15000转速下，离心30min，得到红色沉淀，并用10mM，pH8.0的磷酸缓冲溶液洗涤三次，分散在1mL10mM的pH8.0的磷酸缓冲溶液中得到DNA1/Th/Au@PtNPs电化学探针； (2)金电极的预处理：金电极经0.2μm，0.03μm，0.05μm的α‑A1₂O₃抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，并在超声波水浴中超声5min，用高纯氮气吹干备用； (3)金纳米粒子修饰金电极制备：首先取2～30μL AuNPs溶液滴涂在金电极表面，得金纳米粒子修饰金电极(AuNPs/GE)，置于避光处自然晾干； (4)发卡DNA的预处理：取一定量的1.0×10^‑4M～1.0×10^‑7M的巯基DNA4(或DNA3)于2mL离心管中，置于95℃恒温水浴槽中加热5min，取出后立即置于冰水中冷却1min即得到发卡DNA； (5)电化学传感器的制备：取2～30μL上述预处理后的发卡DNA3滴涂在AuNPs/GE表面，4℃自组装24h；接着取10μL10^‑4M的巯基乙醇滴于电极表面，反应30min，然后用10mM的磷酸缓冲溶液冲洗两次，即得电化学传感器； (6)标准曲线的绘制：取一组浓度梯度的目标DNA2，分别滴加到电化学传感器上，37℃下孵育2h后，取10μL发卡DNA4滴加到电极表面，37℃下孵育4h，然后用10mM，pH8.0的磷酸缓冲溶液冲洗两次；最后，取10μL制备的电化学探针滴加到电极表面，继续孵育1h；然后利用循环伏安法或DPV测得电流强度，根据目标物浓度与电流强度的关系作图得标准曲线，并根据标准曲线计算线性回归方程； (7)样品测定：将含目标DNA2的样品滴加到电化学传感器上，37℃下孵育2h后，取10μL发卡DNA4滴加到电极表面，37℃下孵育4h，然后用10mM，pH8.0的磷酸缓冲溶液冲洗两次；最后，取10μL制备的电化学探针滴加到电极表面，继续孵育1h；然后利用循环伏安法或DPV测得电流强度，根据电流强度，再利用线性回归方程计算样品中目标DNA2含量。