[发明专利]一种保持种子活力的玉米单粒胚乳DNA的提取方法

摘要

本发明公开了属于农业生物技术领域的玉米单粒胚乳DNA的提取方法。本发明先将种子浸泡，然后切去部分胚乳，再加入浸提缓冲液，在55℃水浴后将胚乳研磨；向胚乳中加入CTAB抽提液进行抽提，再加入蛋白酶K和醋酸钠，最后加入饱和酚和氯仿/异戊醇，离心；向上清液中加入异丙醇，离心，用70％乙醇冲洗沉淀，干燥，加入TE中溶解。本发明方法不破坏种子本身的生活力，切除部分胚乳后仍可育苗移栽，利于进行大规模分子标记辅助选择；其次，本发明方法提取的DNA浓度高、纯度高；此外，本发明方法可在室内对育种后代进行分子标记辅助选择，工作效率高，节约人力、物力和财力；最后，本发明被切割种子被感染发霉的概率低，育苗成功率高。

主权项

1.一种保持种子活力的玉米单粒胚乳DNA的提取方法，其特征在于，按照如下步骤进行：（1）、将干玉米种子放在铺有滤纸的培养皿中，然后向培养皿中加入去离子水，使种子完全浸没在水中；再置于光照培养箱里，在25℃、光照12h/天的条件下浸泡种子36～48h；（2）、将步骤（1）中浸泡过的种子取出，用吸水纸吸干种子上的水分，然后用消毒后的手术刀切取单粒种子的胚乳部分, 并且对所述单粒种子的胚不能造成损伤，将切取的胚乳放在规格为2ml的EP管里；其中所切去的胚乳占浸泡后所述单粒种子总重的1/4～1/3；（3）、向步骤（2）的EP管中加入浸提缓冲液400ul，然后在55℃下水浴60min，每隔30min轻摇一次；其中所述的浸提缓冲液的组成成分及其比例为：pH=8.0、200mM Tris-HCl，250mMNaCl，25mM EDTA，0.5%SDS，超纯水 1L；（4）、将步骤（3）的EP管中的所有胚乳和浸提缓冲液倒入研钵中，研磨成匀浆，然后向研钵中加入CTAB抽提液400 ul，摇动研钵，使研钵壁上的胚乳也溶解到CTAB抽提液里，最后将液体倒回到原EP管中；所述的CTAB抽提液的组成成分比例为：2%CTAB，pH=8.0、100mM Tris-HCl，pH=8.0、20mM EDTA，1.4M NaCl，1% PVP和超纯水1L；（5）、向步骤（4）的EP管中加入蛋白酶K 2.5 ul，在65℃水浴40 min，每隔10min轻摇一次；其中所述的蛋白酶K的浓度为20mg/ml；（6）、向步骤（5）的EP管中加入pH 5.2、3M醋酸钠200 ul，然后在-20℃冰箱中静置10min，再向EP管加入65℃预热的饱和酚400 ul和室温下的体积比为24：1的氯仿/异戊醇溶液400 ul，混匀，静置5 min；接着在4℃、12000 rpm条件下离心10 min，吸取上清液900 ul至新规格为1.5ml的EP管中；然后向EP管加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，室温下静置10min，每隔2min轻摇一次；再在4℃、12000rpm条件下离心10 min，倒掉上清液；（7）、向步骤（6）的EP管中加入70%乙醇1000 ul，摇动EP管，用食指轻弹EP管的底部，使管底的DNA沉淀漂浮起来，再在4℃、12000 rpm条件下离心2 min，倒掉上清液；此步骤用70%乙醇重复冲洗2-3次；（8）、将步骤（7）中的EP管倒扣在铺有滤纸的桌面上，静置1min，然后将EP管放在瞬时离心机上离心20s，使管壁的乙醇都聚集到EP管的底部，再用移液枪将管底的乙醇吸干，接着放在通风橱中干燥2～5 min；干燥后，向EP管中加入50ul TE使DNA溶解。