[发明专利]一种定量测定水稻铵转运体蛋白OsAMT1;1 NH4+吸收速率的方法

摘要

本发明公开一种定量测定水稻铵转运体蛋白OsAMT1;1NH₄⁺吸收速率的方法：利用保藏号为CGMCCNo.7254的酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）重组阳性工程菌和对照菌株定量测定其在不同¹⁵NH₄⁺底物浓度条件下的吸收速率，将重组阳性工程菌在每个¹⁵NH₄⁺浓度下的吸收速率减去对照菌株对应浓度下的¹⁵NH₄⁺吸收速率即为水稻铵转运体蛋白OsAMT1;1在相应浓度下的吸铵速率；本发明首次定量测定水稻铵转运体蛋白OsAMT1;1对外界铵的吸收速率，有利于深入研究该基因的功能特性，为今后有效利用该基因进行生物工程育种奠定理论基础。

主权项

一种定量测定水稻铵转运体蛋白OsAMT1;1 NH₄⁺吸收速率的方法，其特征在于：利用保藏号为CGMCC No.7254的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）重组阳性工程菌和对照菌株定量测定其在不同¹⁵NH₄⁺底物浓度条件下的吸收速率，进而获得铵转运体蛋白在相应浓度下的吸铵速率，其中，所述重组阳性工程菌为OsAMT1;1‑pYES2/31019b，所述对照菌株为OsAMT1;1，具体步骤是：a. 挑取所述重组阳性工程菌和对照菌株的单个阳性克隆分别接种于3 ml酵母选择性培养基中，30 ℃，220 rpm培养40 h；b. 将培养后的重组阳性工程菌和对照菌株分别转接至500 ml液体酵母选择性培养基中，接种量为8%，30 ℃，220 rpm摇床培养4 h， 直至它们的OD值均达到0.6；c. 收集并分装步骤b获得的重组阳性工程菌和对照菌株，每离心管200 μl，OD值为40，分别设置5个吸收终浓度，每个吸收终浓度设置3个重复，吸收缓冲液为PBS sodium 缓冲液, pH=5.8，吸收终浓度分别是 0, 0.01, 0.1, 0.5, 1 mM ¹⁵NH₄Cl；d. 分别向步骤c中的离心管中加入100 μl含6% D‑半乳糖的PBS sodium缓冲液，再加入300 μl含吸收终浓度2倍¹⁵NH₄Cl 浓度的PBS sodium缓冲液，30 ℃，220 rpm培养吸收30 min，迅速置于冰上终止吸收；e. 在4 ℃，14000 rpm离心5min，去上清，用PBS sodium缓冲液重悬沉淀，4 ℃，14000 rpm离心5 min，重复操作两次后，取沉淀；f. 将步骤e获得的沉淀置于‑20 ℃, 10 min破裂细胞，然后65 ℃烘干72 h；g. 进行测定, 获得每个样品的含氮比例N%和¹⁵N原子比例；h. 根据g测定结果，计算每个样品的含氮总量和¹⁵N摩尔数，含氮总量=上样量×含氮比例，即每个样品吸收的¹⁵N摩尔数=（每个样品的¹⁵N原子比例‑0.366）×含氮总量/15，其中0.366为¹⁵N的自然丰度 ；i.  根据h中获得的每个样品的¹⁵N摩尔数，则吸收速率=¹⁵N摩尔数/（上样量×30min）, 单位为pmoles/min.μg cells；j. 分别计算每个样品在不同底物¹⁵NH₄⁺浓度下的吸收速率；k. 将重组阳性工程菌在每个¹⁵NH₄⁺浓度下的吸收速率减去对照菌株对应浓度下的¹⁵NH₄⁺吸收速率即为水稻铵转运体蛋白OsAMT1;1在相应浓度下的吸铵速率；所述液体酵母选择性培养基的配方为：0.17% YNB+2% D‑半乳糖+2 mM精氨酸 。