[发明专利]一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法

摘要

本发明提供了一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法，如下：一、构建定点切割单链、双链核酸酶系统及同源序列；二、导入定点切割单链核酸酶系统和同源序列的细胞感染DNA病毒，待细胞病变，收集P1子代病毒；三、导入定点切割双链核酸酶系统的细胞感染P1子代病毒，待细胞病变，收集P2子代病毒；最后从P2子代病毒中分离纯化获得目的子代病毒。上述二为病毒基因组同源重组步骤，在不引入随机突变的情况下，提高病毒基因组同源重组效率约十万倍；上述三为特异性扩增步骤，进一步提高特异性突变病毒在子代病毒中的比例约十倍左右。本发明能有效控制突变类型，并快速方便地筛选获得具有特定突变、缺失或插入的重组病毒。

主权项

一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法，其特征在于：是通过以下步骤实现的：步骤一，构建定点切割的核酸酶系统：构建至少一个包含导向功能的分子和具有定点切割单链DNA活性的蛋白核酸酶系统Ⅰ，以及包含导向功能的分子和具有定点切割双链DNA活性的蛋白核酸酶系统Ⅱ；步骤二，构建包含有特异性突变、缺失或插入序列的同源序列；步骤三，将步骤一构建的蛋白核酸酶系统Ⅰ和步骤二构建的同源序列共同转染细胞，得到转染细胞，其中，控制细胞数量与表达核酸酶系统Ⅰ的质量之间的比例为1×10⁵:0.1‑2μg，控制细胞数量与同源序列的质量之间的比例为1×10⁵:0.1‑2μg；步骤四，向经步骤三处理后的细胞培养板的每个孔中加入病毒液，吸附，然后吸去病毒液，再加入细胞维持液，培育至细胞病变，得到病变细胞Ⅰ；步骤五，收集步骤四得到的病变细胞Ⅰ和/或上清，冻融或超声处理后，离心去除细胞碎片，所得上清即为子代病毒收获液P1；步骤六，将步骤一中构建的蛋白核酸酶系统Ⅱ转染细胞，得到转染细胞，其中，控制细胞数量与蛋白核酸酶系统Ⅱ的质量之间的比例为1×10⁵:0.1‑2μg；步骤七、向经步骤六处理后的细胞培养板的每个孔中加入步骤五得到的子代病毒收获液P1，吸附，然后吸去病毒液，再加入细胞维持液，培育至细胞病变，得到病变细胞Ⅱ；步骤八，收集步骤七得到的病变细胞Ⅱ和/或上清，冻融或超声处理后，离心去除细胞碎片，所得上清即为子代病毒收获液P2；步骤九，从步骤八得到的子代病毒收获液P2中，挑取来源于单克隆的子代病毒，通过核酸测序鉴定，分离出纯化得具有特异性突变的子代病毒；完成DNA病毒基因组的特异性定点改造及筛选方法。