[发明专利]草鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法

摘要

本发明提供了一种草鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法。所述方法按下列步骤进行：1、草鱼个体DNA提取；2、草鱼多态性微卫星引物的筛选；3、草鱼微卫星多重PCR条件的优化和扩增；4、亲子鉴定。本发明利用微卫星标记与多重荧光PCR技术结合，筛选了13个高度多态性微卫星位点，组建3个多重荧光PCR体系，通过测序仪分型，对草鱼家系进行高通量个体识别和亲子关系分析；本发明的建立为草鱼种质鉴定、家系管理和增殖放流效果评估提供了一种新的技术手段。

主权项

一种草鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，其特征在于：所述方法按下列步骤进行：（1）、草鱼个体DNA提取剪取草鱼鳍条或其他组织，采用常规酚‑氯仿的方法或者高盐法提取基因组DNA，并将DNA稀释至约100 ng/μl；（2）、草鱼多态性微卫星引物的筛选根据文献发表的草鱼微卫星引物序列，合成引物，并分别对20个野生草鱼个体进行PCR扩增，筛选出扩增稳定、多态性强、杂合度高的引物；跟引物的退火温度、等位基因大小以及引物序列，设计成不同的多重PCR，本发明共筛选出13对草鱼微卫星引物：CID12、CID0015、CID0025、CID0029、CID0037、CID0177、CID0276、CID0321、CID0327、CID0367、CID0388、HLJC115、HLJC116；（3）、草鱼微卫星多重PCR条件的优化和扩增将上述筛选出来的13对引物，组合成3个多重PCR，多重PCR组合1引物为CID12、CID0025、CID0327、CID0367、CID0388；多重PCR组合2引物为CID0015、CID0029、CID0321、HLJC116；多重PCR组合3引物为CID0037、CID0177、CID0276、HLJC115，其中每一对引物的正向引物的5'端标记上荧光物质，CID12、CID0015、CID0025、CID0029、CID0037、CID0177、CID0276、CID0321、CID0327、CID0367、CID0388、HLJC115、HLJC116的荧光物质分别是FAM、HEX、FAM、FAM、TAMRA、FAM、HEX、FAM、TAMRA、TAMRA、HEX、HEX、TAMRA；多重PCR组合1的PCR体系为总体积25μL，包括基因组DNA 100 ng，10×PCR缓冲液2.5 μL，Mg²⁺ 2.3mM，Taq DNA聚合酶2U，CID12、CID0025、CID0327、CID0367、CID0388正反引物各0.5 μM，补充灭菌双蒸水至25μL，PCR反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃再延伸6min，最后16℃保存；多重PCR组合2除引物之外的PCR体系和反应条件与多重PCR组合1的相同；多重PCR组合3的PCR体系为总体积25μL，包括基因组DNA 100 ng，10×PCR缓冲液2.5 μL，Mg²⁺ 2.3mM，Taq DNA聚合酶2U，CID0037、CID0177、HLJC115正反引物各0.5 μM，CID0276正反引物各为0.7μM、补充灭菌双蒸水至25μL，PCR反应条件与多重PCR组合1的PCR条件相同；（4）、亲子鉴定将多重PCR产物在测序仪上进行分型，读取个体等位基因大小bp，即碱基对，排成数字基因型矩阵，采用软件Cervus v3.0对数据进行分析，根据待测个体与亲本基因型之间的相关性，确定待测个体与哪个亲本具有亲子关系。