[发明专利]一种破坏烟曲霉生物膜的方法

摘要

本发明提供一种破坏烟曲霉生物膜的方法，包括制备药物、收集菌株、制备载体、制备孢子悬液、药物敏感试验、制备烟曲霉生物膜载体、药物对烟曲霉生物膜作用和结晶紫半定量，本发明利用金银花提取物的绿原酸破坏烟曲霉生物膜，用亚抑菌浓度的绿原酸破坏早期和成熟期的烟曲霉生物膜，本发明的亚抑菌浓度的绿原酸对早期及成熟期烟曲霉生物膜均具有破坏作用，破坏效果呈现出浓度依赖性。

主权项

一种破坏烟曲霉生物膜的方法，包括制备药物、收集菌株、制备载体、制备孢子悬液、药物敏感试验、制备烟曲霉生物膜载体、药物对烟曲霉生物膜作用和结晶紫半定量，其特征在于，用金银花提取物的绿原酸破坏烟曲霉生物膜，具体步骤如下：1）制备药物 取400~500mg绿原酸用3~6ml 100%的二甲亚砜溶解，配制成浓度为102400μg/ml的溶液，于‑20℃~‑25℃储存；2）收集菌株 收集烟曲霉菌株，质控菌株为近平滑念珠菌；3）制备载体 将直径为10~15 mm玻璃细胞爬片进行高温高压灭菌，作为载体；4）制备孢子悬液 将步骤2）收集的菌株接种到PDA培养皿，置于35~37℃生化培养箱进行复苏，后转至另一个PDA培养皿并置于35~37℃生化培养箱活化3~5天后，用5~10ml含有0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~30ml MOPS缓冲的RPMI‑1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI‑1640液体培养液调整浓度为1~3×106·孢子·ml‑1，再用RPMI‑1640液体培养基稀释50倍，得到2倍终浓度的孢子悬液；5）药物敏感试验 微量液基稀释法，在无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔加入步骤4）制备的孢子悬液，再将步骤1）制备的绿原酸置于无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔，第1孔加入量为100μl，第2~10孔依次倍比稀释至二倍终浓度，第11孔为步骤4）制备孢子悬液的生长对照孔，第12孔为MOPS缓冲的RPMI‑1640液体培养基，静置于35~37℃培养48h，获得绿原酸的最低抑菌浓度MIC； 6）制备烟曲霉生物膜载体A：早期模型建立 将步骤2）收集的菌株接种到PDA培养皿，置于35~37℃培养箱培养活化3~5天，用5~10ml含有0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~25ml MOPS缓冲的RPMI‑1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI‑1640液体培养液调整浓度为1~5×105·孢子·ml‑1，将1~2ml孢子悬液放在步骤3）制备的载体上，静置于35~37℃生化培养箱中培养；培养24h时载体上为早期烟曲霉生物膜；B：成熟期模型建立 将步骤A制备的烟曲霉生物膜培养48h时载体上为成熟期烟曲霉生物膜；7）药物对烟曲霉生物膜作用 将步骤6）制备的两种模型烟曲霉生物膜载体用无菌磷酸盐缓冲液漂洗，后放入新的无菌载体中，按步骤5）获得的绿原酸最低抑菌浓度MIC，加入亚抑菌浓度的绿原酸，每个孔加入量为1ml，空白组为MOPS缓冲的RPMI ‑1640液体培养基，静置于35~37℃培养48~50h，后取出载体，进行结晶紫半定量；8）结晶紫半定量  吸取步骤7）载体表面浮游菌液，室温干燥，取1~2ml 1%结晶紫染色20~30min，用磷酸盐缓冲液洗脱未结合的结晶紫，室温干燥，用1~2ml 95%乙醇脱水3~5min，取100~110μl洗脱液于96孔酶标板中，在波长为570nm处测各孔酶标值。