[发明专利]一种快速高效的引入定点突变的方法

摘要

本发明公开了一种快速高效地引入定点突变的方法，该方法以整合型质粒YIplac211为载体，以其携带的URA3基因为筛选标记，通过正向重复序列的两次同源重组，实现了定点突变的引入。本发明在引入定点突变的同时并未有外源基因的残留，保证了菌株的安全性。此外，本发明也可运用于除酵母以外的其他工业菌株。

主权项

一种快速高效引入定点突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）根据突变碱基的位置，设计包含酶切位点的正向、反向引物，PCR扩增含有定点突变的片段；将PCR产物与YIplac211质粒同时酶切，用T4聚合酶连接；将连接体系导入DH5α感受态细胞，获得重组质粒，酶切验证，测序鉴定；（2）获得工业菌株的尿嘧啶营养缺陷型：设计正向、反向引物，从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W303‑1a扩增突变基因ura3,用醋酸锂转化法导入出发菌株，获得其尿嘧啶营养缺陷菌株；（3）在突变片段上选择一个合适单一酶切位点将（1）中重组质粒线性化；运用醋酸锂转化法，将其导入步骤（2）获得的营养缺陷型菌株，通过正向重复序列的第一次重组，将质粒序列整合到了基因组上，在不含尿嘧啶的完全合成培养基上筛选阳性转化子同时菌落PCR加以验证；（4）将（3）得到的阳性转化子，涂布在含5‑氟乳清酸的完全合成培养基上，基因组发生第二次重组，将质粒弹出，可得到野生型菌株和定点突变的菌株；（5）通过测序得以最终确定携带定点突变的菌株；（6）用（2）中引物扩增正常的URA3基因，将其导入（5）获得的菌株，回复其营养缺陷。