[发明专利]鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法

摘要

本发明提供一种鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞（cornealendothelialcells,CECs）新的分子标记物的方法，确定了245个在胎儿期角膜内皮细胞和284个在成人期角膜内皮细胞高表达的特异基因，鉴定了四个新的胎儿和成人角膜内皮细胞的分子标记物为Wnt5a、S100A4、S100A6和IER3。本发明提供的一种鉴定胎儿和成人角膜内皮细胞的方法，通过该方法确认了四个新的胎儿和成人角膜内皮细胞的分子标记物为Wnt5a、S100A4、S100A6和IER3。角膜内皮细胞（CECs）发育过程中阶段特异性标记物的确定将对定义由干细胞分化而来的CECs以及细胞替代治疗角膜内皮相关疾病具有重要意义，弥补了现有技术中鉴定人角膜内皮细胞的标记物不足的缺憾。

主权项

一种鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法，其特征在于，包括以下几步：（1）胎儿和成人角膜内皮细胞中组织特异性基因表达A：从Illumina系统的RNA‑Seq公共数据库中获得12种不同类型细胞和组织，共计97个样本；B：确定了245个在胎儿期角膜内皮细胞和284个在成人期角膜内皮细胞高表达的特异基因；（2）胎儿和成人角膜内皮细胞之间基因差异性表达C：比较成人和胎儿角膜内皮细胞表达谱，分别得到了在成人和胎儿角膜内皮细胞中高表达的518个和668个基因；D：通过GO基因注释分析和KEGG通路分析，得到S100蛋白家族在成人角膜内皮细胞中的表达量高，所述S100蛋白家族为钙结合蛋白，其包括S100A4, S100A5和S100A6；（3）在蛋白水平验证并确认成人和胎儿的角膜内皮细胞中的阶段特异性标记基因E：检测Wnt信号通路组分，基因分析结果显示，参与Wnt信号通路的基因在胎儿角膜内皮细胞高度富集，而免疫组化结果显示，该信号通路的胞内信号分子在成人和胎儿角膜内皮细胞中均表达；但是Wnt5a只在胎儿角膜内皮细胞表达，而在成人角膜内皮细胞不表达，说明在蛋白水平，Wnt5a通路仅在胎儿角膜内皮细胞发挥功能而在成人角膜内皮细胞并无此功能，即Wnt5a是成人和胎儿角膜内皮细胞的新标记物；F：通过免疫组化验证了，所述S100A4和S100A6蛋白在成人膜内皮细胞和胎儿角膜上皮细胞表达，而在胎儿角膜内皮细胞不表达，得到S100A4和S100A6钙结合蛋白是两个区分成人和胎儿角膜内皮细胞的新标记物；G：检测成人和胎儿角膜内皮细胞高表达的蛋白在细胞中定位，结果显示在角膜内皮细胞成熟过程中，以应激诱导蛋白IER3为代表的胞内蛋白的新定位，免疫组化结果显示，IER3在胎儿和成人角膜内皮细胞中均有表达，但在亚细胞定位表达完全相反，IER3在成体角膜内皮细胞，定位于细胞质中，而在胎儿角膜内皮细胞则定位于细胞核中，IER3为判定角膜内皮细胞发育程度的蛋白标记物。