[发明专利]鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，更具体地，涉及鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记方法。

背景技术

角膜内皮细胞（corneal endothelial cells, CECs）位于角膜最内层，为一单层六角形立方上皮，胞质内细胞器含量丰富，细胞间连接紧密，主要为缝隙连接，具有良好的屏障作用。角膜内皮细胞膜上存在Na⁺-K⁺-ATP酶，该酶参与钠、钾离子的交换过程，主动将Na⁺转至细胞外，并将K⁺泵入细胞内，从而维持细胞膜内外的离子浓度梯度。角膜内皮细胞Na⁺-K⁺-ATP酶在进行离子转运的同时，也将水分子从基膜侧（基质）转运到顶膜侧（房水），以抵消基质通过角膜上皮和内皮时被动性水吸收带来的肿胀趋势，从而维持角膜基质的相对脱水状态和角膜的透明性。成人角膜内皮细胞失去有丝分裂能力，细胞停留在G1期。由遗传性疾病、创伤和老化等导致的角膜内皮细胞缺陷将导致角膜不可逆水肿、失去透明性并最终导致失明。

角膜内皮细胞的遗传性紊乱，包括富克斯角膜内皮营养不良（Fuchs endothelial coneal dystrophy, FECD）、后部多形性角膜营养不良（posterior polymorphous coneal dystrophy, PPCD）、先天遗传性内皮营养不良1型和2型（congenital hereditary endothelial dystrophy type 1 and 2, CHED1 and CHED2）、X连锁性角膜内皮营养不良（X-linked endothelial corneal dystrophy, XECD）等。近年来，有关这些遗传性角膜营养不良症的遗传学机制有了陆续的研究和报道。比如，有研究指出，后弹力层（由角膜内层上皮细胞分泌而来）的主要组成成分—VIII A2型胶原蛋白（COL8A2)—的变异，与早期FECD及PPCD相关；而溶质携带物家族A11 (SLC4A11)的变异与迟发性FECD及PPCD2相关。鉴于目前的研究现状，更多的靶基因有待发现。

临床上，除了移植整个角膜，内角膜移植术和后弹力层角膜内皮移植术等眼科手术也可以用于替代功能性失调CECs，但均存在供体细胞来源缺乏和免疫排斥等问题。干细胞的发展为获得功能性的CECs提供了全新的思路，有研究者从神经嵴细胞分化得到CECs，以及有用人类成体干细胞，比如角膜内皮基质干细胞、间充质干细胞、骨髓内皮祖细胞分化得到CECs的报道。理论上讲，通过体外多能干细胞（人类胚胎干细胞或诱导多能干细胞）分化，可以获得无限量的CECs用于细胞替代治疗。

目前，研究者多以蛋白标记物用于鉴定成人CECs，这些蛋白多与细胞黏附、缝隙连接以及泵功能相关，比如N-钙黏着蛋白（N-cadherin）、间隙连接蛋白43（connesin-43）、ZO-1、Na⁺-K⁺-ATP酶（Na⁺-K⁺-ATPase）和密封蛋白（Occludin）等。但是，与CECs成熟过程相关的分子通路和胎儿/成体CECs特异的分子标记物的研究少之又少。

发明内容

本发明解决了现有技术中鉴定人角膜内皮细胞的标记物的不足，提供一种基于RNA-Seq技术及生物信息学分析用于鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法。

本发明的技术方案为：一种鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法，包括以下几步：

（1）胎儿和成人角膜内皮细胞中组织特异性基因表达

A：从Illumina系统的RNA-Seq公共数据库中获得12种不同类型细胞和组织，共计97个样本；

B：确定了245个在胎儿期角膜内皮细胞和284个在成人期角膜内皮细胞高表达的特异基因；

（2）胎儿和成人角膜内皮细胞之间基因差异性表达

C：比较成人和胎儿角膜内皮细胞表达谱，分别得到了在成人和胎儿角膜内皮细胞中高表达的518个和668个基因；

D：通过GO基因注释分析和KEGG通路分析，得到S100蛋白家族在成人角膜内皮细胞中的表达量高，所述S100蛋白家族为钙结合蛋白，其包括S100A4, S100A5和S100A6；

（3）在蛋白水平验证并确认成人和胎儿的角膜内皮细胞中的阶段特异性标记基因