[发明专利]利用高分辨熔解曲线分析技术检测PAH基因突变的方法

摘要

本发明公开了一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测PAH基因突变的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，设计PAH基因第3、6、7、11和12外显子序列为模板的检测引物，根据高分辨熔解曲线分析技术对PCR扩增后的基因序列进行突变检测。本发明灵敏度高、特异性好，检测速度快，可实现对苯丙氨酸羟化酶基因常见突变位点的快速筛查，在PAH基因突变检测方法方面提供了一个新依据。

主权项

一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测PAH基因突变的方法，其特征在于，具体步骤为： 第一步： 采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，采用电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到10ng/ul；正常人样本DNA为阴性对照；第二步：根据PAH基因的保守区域，采用在线软件Primer 3设计PAH基因第3、6、7、11和12外显子HRM引物，确定最佳引物为18‑25bp大小，PCR产物长度180‑300bp；相关引物信息如下：PAH基因外显子3引物序列：PAH‑E3‑F  5′‑ccctccccattctctcttct‑3′PAH‑E3‑R  5′‑gacagtgtggagttacttatgttgc‑3′PAH基因外显子6引物序列：PAH‑E6‑F  5′‑gccctgcttgagacacctat‑3′PAH‑E6‑R  5′‑TCTGCAGGAAcTGAGAAACG‑3′PAH基因外显子7引物序列：PAH‑E7‑F  5′‑ttcttttcatcccagCTTGC‑3′PAH‑E7‑R  5′‑aaaagatggcgctcattgtg‑3′PAH基因外显子11引物序列：PAH‑E11‑F  5′‑cttttcacttggggcctaca‑3′PAH‑E11‑R  5′‑agtggctcacctttgtcacc‑3′PAH基因外显子12引物序列：PAH‑E12‑F  5′‑ccttcactcaagcctgtggt‑3′PAH‑E12‑R  5′‑aaccgagtggcctcgtaag‑3′第三步：每个样本分别进行5个PCR反应，每个PCR反应的总体系为15ul（包括Type‑it HRM PCR Mix 7.5ul、正向引物溶液0.5ul及反向引物溶液0.5ul，样本DNA 2ul，灭菌重蒸馏水4.5ul）；在Rotor‑Gene Q上进行反应，PCR反应条件为92‑97℃变性5‑15分钟，92‑97℃变性10‑30秒，57‑65℃退火10‑30秒，70‑75℃延伸10‑30秒，30‑50个循环；HRM反应条件：92‑97℃变性1分钟，40℃复性1分钟，初始熔解温度60‑65℃开始程序升温熔解至95℃，过程中实时监测荧光信号，30‑50次每秒；第四步：应用Rotor‑Gene Q软件分析HRM结果，通过标准曲线基于曲线偏移和曲线形状变化展现不同的基因型；定义已知的正常对照样本后，软件会自动调出所有检测样本的基因型。