[发明专利]一种获得具有不同表型花椰菜材料的方法及应用

摘要

本发明公开了一种简单、高效大规模获得具有不同表型花椰菜材料的方法及应用。使用上述方法获得具有不同表型花椰菜材料包括：（1）花椰菜无菌苗的培养；（2）农杆菌GV3101的培养；（3）农杆菌的遗传转化；（4）Basta筛选；（5）阳性苗的炼苗与移栽；（6）不同表型花椰菜材料的生物学性状观察：根据获得的不同花椰菜材料的性状表现判断其是否符合育种目标。采用该种方法可以短时间、大规模获得具有不同表型花椰菜材料，其对于获得符合不同育种目标花椰菜亲本材料具有重要应用价值。

主权项

采用T‑DNA插入技术获得具有不同表型的花椰菜材料的方法，其特征在于它按如下的步骤进行：一、花椰菜无菌苗的培养：取适量花椰菜种子，用蒸馏水加上吐温浸泡种2h，弃掉蒸馏水，用75%酒精表面消毒3min，再用2%次氯酸钠消毒15min，之后用灭菌蒸馏水冲洗种子3次，每次2min，然后种到萌发培养基上，培养条件为24±2℃，光照时间16h；所述的萌发培养基成分为：MS无机盐+0.5%（w/w）琼脂粉；二、农杆菌GV3101的培养：配制YEB培养基，分装到小三角瓶中，每瓶20 mL，在其中加入抗生素利福平、氨苄青霉素、卡那霉素，终浓度为50 mg/L，按照1:100的比例将保存的农杆菌菌液接种到YEB培养基中，扩大培养至OD=0.8‑1.0，备用；所述的YEB培养基成分为：Beef extract 5g/L，Yeast extract 1g/L，Peptone 5g/L，sucrose 5g/L，MgSO4·7H2O，pH 7.4；三、农杆菌的遗传转化：（1）外植体获取及预培养：待种子萌发到第5‑6天时，在无菌条件下将下胚轴切成3‑4段，每段大约7‑8mm，平铺放到预培养基上，进行预培养2d；所述的预培养基成分为：MS+ NAA 0.1 mg/L+6‑BA 1 mg/L；（2）侵染：将预培养后的外植体转移到小烧杯中后，加入事先活化的上述菌液中，浸泡30s，结束后将菌液过滤掉，用滤纸把剩余的菌液吸干；（3）共培养：侵染后的外植体依旧像预培养时一样转移到新的共培养培养基上，共培养时间为2d，且在黑暗条件下进行；所述的共培养培养基成分为：MS+ NAA 0.1 mg/L+6‑BA 1 mg/L；（4）抑菌培养：共培养结束后，外植体用清水冲洗3‑4遍，滤纸吸干剩余水分，将其以同样方式放到抑菌培养基上，一周后将Cef浓度减半；所述的抑菌培养基成分为： MS+ NAA 0.1 mg/L+6‑BA 1 mg/L+Cef 200 mg/L；四、Basta 筛选：pSKI015T‑DNA载体上带有Basta抗性基因，因此可用Basta进行抗性筛选，将抑菌培养2 week 后的下胚轴转入筛选分化培养基进行筛选，待不定芽长至2‑3 cm时，切下绿色不定芽，转移至生根培养基继续筛选并诱导生根；所述的筛选分化培养基为：含Cef 100 mg/L，Basta 3 mg/L；所述的生根培养基为：含Cef 100 mg/L，Basta 1.5 mg/L；五、阳性苗的炼苗与移栽：待阳性苗主根生长粗壮时，敞开瓶口炼苗3d，之后移栽到花盆，转移到光照培养箱，用保鲜膜覆盖以保持较高的相对湿度，待幼苗长出新叶之后，移栽到温室培养；六、获得花椰菜新材料的生物学性状观察：在T‑DNA插入阳性苗在温室生长期间，对其生物学性状进行不间断的观察并记录表型变化特征。