[发明专利]利用原生质体转化构建黑根霉CPR基因工程菌的方法有效
申请号: | 201310316876.2 | 申请日: | 2013-07-24 |
公开(公告)号: | CN103695455A | 公开(公告)日: | 2014-04-02 |
发明(设计)人: | 陈小龙;顾光志;朱廷恒;嘉晓勤;范永仙;沈寅初 | 申请(专利权)人: | 浙江工业大学;台州仙琚药业有限公司 |
主分类号: | C12N15/80 | 分类号: | C12N15/80;C12N1/15;C12N1/14;C12R1/845 |
代理公司: | 杭州天正专利事务所有限公司 33201 | 代理人: | 黄美娟;冷红梅 |
地址: | 310014 浙*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | 本发明提供了一种利用原生质体转化技术对黑根霉(Rhizopus nigericans)进行外源基因的遗传转化方法:利用真菌细胞壁降解酶对黑根霉(Rhizopus nigericans)的细胞壁进行处理,得到原生质体并进行纯化,以潮霉素B作为选择标记,首次将来自米根霉NADPH-细胞色素P450还原酶CYPOR(缩写:CPR基因)基因采用原生质体转化方法导入黑根霉中,获得工程菌。本发明的有益效果体现在:可以用于黑根霉的分子生物学研究,如研究该菌P450酶系基因对甾体化合物羟化作用的分子机制等;可以用来对黑根霉实施基因工程从而进行遗传改良育种,提高黑根霉对甾体底物羟化转化率。 | ||
搜索关键词: | 利用 原生 质体 转化 构建 黑根霉 cpr 基因工程 方法 | ||
【主权项】:
一种利用原生质体转化构建黑根霉CPR基因工程菌的方法,所述方法包括:(1)从米根霉克隆得到其CPR基因,克隆至质粒pCB1004‑pgpd,得到表达质粒pCB1004‑pgpd‑CPR;(2)将黑根霉孢子原生质体用1mol/L的山梨醇溶液悬浮,调节原生质体浓度为107~108个/mL,得到原生质体溶液;所述山梨醇溶液组成如下:1mol/L山梨醇,10mmol/L Tris‑Cl,50mmol/L CaCl2,溶剂为水,pH7.0;(3)将构建的表达质粒pCB1004‑pgpd‑CPR经限制性内切酶酶切,酶切产物纯化后溶于无菌去离子水至浓度为10~15μg/mL,得到线性化质粒溶液;(4)每100μL原生质体溶液加入10μL线性化质粒溶液,并加入1~2μL步骤(3)所述限制性内切酶,混匀,冰浴30min后,加入20~50μL的PEG4000‑CaCl2溶液,冰浴10~20min;再加入400~800μL的PEG4000‑CaCl2溶液,室温静置10~15min;所述PEG4000‑CaCl2溶液组成如下:PEG400060%,CaCl250mmol/L,山梨醇1mol/L,Tris‑Cl10mmol/L,溶剂为水,pH7.0;(5)步骤(4)转化液转移至10mL MYG液体再生培养基,28℃、80rpm,培养12h后,离心,用无菌去离子水洗涤,获得菌悬液涂布于含有150μg/mL潮霉素B的MYG固体平板,28℃培养;(6)待平板上长出菌丝后,转接到含有150μg/mL潮霉素B的MYG固体平板上;转化子在潮霉素B浓度200μg/mL的MYG固体平 板上继代培养,提取转化子基因组,进行PCR确定目的基因片段是否整合到黑根霉基因组中,鉴定正确后保存。
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- 2018-06-29 - 2018-12-21 - C12N15/80
- 本发明涉及一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体及其构建方法和应用,将带有点突变的琥珀酸脱氢酶铁硫亚基的DNA片段连入质粒载体,记为pTSdi。本发明的转化载体可以用于转化杏鲍菇,使其获得对真菌杀菌剂萎锈灵的抗性;另外由于在构建的转化载体中留有插入外源基因片段的酶切位点,可以方便地插入感兴趣的外源基因,转化到杏鲍菇中进行遗传学研究,具有良好的应用前景。
- 提高里氏木霉转化效率的重组表达载体及应用-201810819850.2
- 姚斌;苏小运;孙先花;罗会颖;黄火清;王亚茹;柏映国;涂涛;王苑;孟昆 - 中国农业科学院饲料研究所
- 2018-07-24 - 2018-11-30 - C12N15/80
- 本发明属于农业生物技术领域,具体涉及提高里氏木霉转化效率的重组表达载体及应用。本发明的提高里氏木霉转化效率的重组表达载体,将两段序列构建于质粒载体中,并在两个序列之间添加了核酸酶I‑CeuI的识别位点。相对于未添加上述序列的质粒,本发明的重组表达载体的转化效率提高了2倍以上。
- 一种可用于丝状真菌基因敲除的载体及应用-201810860075.5
- 华丽霞;叶鹏盛;何炼;蒋秋平;曾华兰;张敏;王明娟;黄玲;代顺冬;赖佳;韦树谷;张骞方 - 四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所
- 2018-08-01 - 2018-11-27 - C12N15/80
- 一种可用于丝状真菌基因敲除的载体及应用,其载体由以下方法构建:A、以碱基序列为SEQ ID NO:1所示的(5’‑3’)引物与碱基序列为SEQ ID NO:2所示的(5’‑3’)引物,通过超保真DNA聚合酶,对pBHT2载体质粒进行扩增,得到含TrpC‑Hyp基因的核苷酸片段;B、用Hind III限制性内切酶和Pst I限制性内切酶对pGKO2载体进行酶切,得到线性化的pGKO2载体;再将含TrpC‑Hyp基因的核苷酸片段与线性化的pGKO2载体连接,即得。该载体用于丝状真菌基因敲除,可减少同源重组载体构建的步骤,提高阳性转化子的筛选效率,有利于真菌基因的功能研究和开发。
- 一种双基因共表达重组载体及其构建方法和在三孢布拉霉中的应用-201510491355.X
- 张利平;高新芝;汤晖;李继刚;杨普城 - 河北大学
- 2015-08-12 - 2018-10-30 - C12N15/80
- 本发明公开了一种双基因共表达重组载体,在初始载体中携带有基因表达框序列syn,所述基因表达框序列syn含有:终止子—多克隆位点—双向启动子序列PCarB—TA克隆制备序列—终止子,所述基因表达框序列syn的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:1所示;在所述初始载体中还携带有潮霉素抗性基因hygR,所述潮霉素抗性基因hygR的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:2;具体构建了一个双基因共表达重组载体pPMPT,为在初始载体pATZ中含有基因表达框序列syn和潮霉素抗性基因hygR,其核苷酸序列如SEQ.ID.NO:3所示,同时还公开了该载体的构建方法以及在丝状真菌三孢布拉霉中的应用。本发明提供的重组载体可在一个质粒上同时添加两个基因,而且通过农杆菌介导可以整合到丝状真菌基因组中,以单拷贝插入,实现双基因共表达,其遗传稳定。
- 由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法-201810526455.5
- 胡志宏;曾斌;孙云龙;牛亚丽 - 江西科技师范大学
- 2018-05-29 - 2018-10-19 - C12N15/80
- 本发明提供了一种由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法,该方法主要包括以下步骤:(1)将植物双元载体改造成含有prtA表达盒的双元表达载体,含有GPDA启动子和GPF报告基因;(2)双元载体转化农杆菌AGL1;(3)在DPY培养基培养野生型米曲霉3.042,3天后洗下孢子;(4)孢子与含有目的载体的农杆菌共培养48小时;(5)共培养后的孢子转移到含有头孢和吡啶硫胺素的CD培养基筛选;(6)筛选培养基生长出来的转化子进一步验证。本发明首次建立了农杆菌介导的以吡啶硫胺素为筛选标记的转基因体系,较原来的原生质体介导的转基因体系减少工作量,提高了转化效率,为米曲霉遗传操作奠定了基础。
- 高表达植酸酶的食药用真菌菌丝饲料添加剂-201510462708.3
- 李海燕;陈欢;李晓薇;李玉;王法微;李晰亮;刘秀明;姚娜;董园园;王南;王琦;王秀然;卢天成;王岩;孙喆;孙天旭 - 吉林农业大学
- 2015-08-01 - 2018-10-16 - C12N15/80
- 本发明公开了高表达植酸酶的食药用真菌菌丝饲料添加剂,通过构建真菌特异性表达植酸酶phyA基因的安全表达载体pCB130NG‑phyA,并转入蛹虫草原生质体,再生获得转基因蛹虫草子实体后,以子实体为母种,培养制得转基因蛹虫草菌丝,PDA液体培养基培养,离心收集菌体,烘干粉碎制得高表达植酸酶的食药用真菌菌丝饲料添加剂,可直接添加于饲料中饲喂动物,不仅能增加动物对磷的利用率,能大大提高养殖动物各期平均日增重和料肉比,促进动物生长,增强动物免疫能力,而且具有无耐药性、改善动物产品品质等优点,而且使磷的排泄量降低了32.14‑56.14%,从而有利于增加养殖效益,降低对环境的污染,应用前景十分诱人。
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