[发明专利]小鼠肝脏原代细胞分离方法

摘要

本发明属于细胞技术领域，特别涉及一种小鼠肝脏原代细胞分离方法，以进一步培养，用于模拟肥胖和非肥胖状态下的NAFLD，来检测BBR的治疗效果。本发明提供了一种简单、经济、快速的小鼠原代肝脏细胞分离方法，适用于一般实验室的小鼠原代肝脏细胞分离以及进一步培养，为后续实验提供基础。以本发明所获得的小鼠原代肝脏细胞进行进一步培养，建立体外细胞模型，进行验证BBR在治疗非肥胖小鼠的脂肪肝方面的功效，获得了良好的效果，为验证BBR在治疗肥胖与非肥胖NAFLD方面的功效起到了积极作用，为治疗NAFLD的药物的研制提供了基础条件。

主权项

一种小鼠肝脏原代细胞分离方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）配制Ⅳ型胶原酶：称取0.0125gⅣ型胶原酶加入盛有20mL的Hanks培养液中，配制成终浓度为0.05%的Ⅳ型胶原酶，0.45μM滤器过滤，放入37℃水浴锅中温育；（2）取一只准备好的小鼠麻醉，肌注肝素抗凝；（3）固定，剪开皮毛，用棉签将肠胃向右拨开，露出门静脉，用细弯镊游离门静脉，垫入细线，上下各1根；（4）用10mL注射器吸取已预热的无钙D‑Hanks，连接至套管针；（5）向门静脉中插入套管针，拔出一点针头，结扎细线固定针；（6）推入无钙D‑Hanks6‑9mL，同时用棉签轻拍肝脏，至肝脏变白；（7）剪下肝脏，放入10cm平皿中，用10mL注射器吸取胶原酶，缓缓推入，同时用棉签轻拍肝脏，观察肝脏的变化，重复4‑5次，待肝脏包膜破裂，用镊子撕扯包膜；（8）将撕碎的肝脏用100目筛网滤入50mL离心管中，500rpm，4℃离心5min；（9）弃上清，加入1×PBS20mL重悬，混匀离心，此步骤重复3次；（10）加入原代细胞培养液hepatocyte medium，接种至12孔细胞板中培养；（11）24h后换高糖DMEM培液。