[发明专利]一种混合干细胞注射剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种混合干细胞注射剂及其制备方法，属于细胞制剂领域。本发明的注射剂是由脐带来源的间充质干细胞和脐血来源的造血干/祖细胞的混合物，其制备方法是从新鲜脐血中分离纯化CD34+的造血干细胞，并与脐带来源的间充质干细胞混合培养扩增，扩增过程培养体系为含体积分数为15%AB脐血浆的培养基及细胞因子，接种6×104个间充质干细胞和5×104个/ml浓度CD34+造血干细胞到培养瓶中，培养10天左右，同时收获两种细胞，制备成含5×105个/ml的造血干/祖细胞和2×105个/ml的间充质干细胞的含有体积分数为5%AB脐血浆的生理盐水的混合干细胞注射剂。

主权项

一种混合干细胞注射剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）脐带间充质干细胞的分离和原代培养：将脐带去掉外层羊膜和剔除血管，去除残余血液，留取沃顿胶质，将沃顿胶质剪成1mm2的组织块，平铺在T25培养瓶底，加入MSC无血清培养基，置于37℃，饱和湿度，浓度5%的CO2条件下培养6～8天，细胞进行换液继续培养；（2）间充质干细胞的培养和传代：步骤（1）换液培养3‑4天后细胞进行传代，用质量分数为0.25%胰酶消化1分钟，MSC无血清培养基终止消化，500g离心去上清，留取细胞沉淀，用MSC无血清培养基重悬，接种在T75培养瓶中培养，按1：3的比例传代，三天传代一次，取第3代间充质干细胞与造血干细胞共培养；（3）脐血造血干细胞的分离和培养：新鲜脐血经Ficoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，收集细胞沉淀，用含有EDTA和人血清白蛋白的PBS缓冲液再洗一次，离心力200g，离心时间10分钟；离心完后，收集细胞沉淀，用30ml含有EDTA和人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬，MiniMACS免疫磁珠分选法从单个核细胞中纯化出高表达CD34+的造血干细胞；分选出的CD34+造血干细胞与间充质干细胞按照15：1的数量比，同时接种在T75培养瓶中，根据得到的CD34+造血干细胞的数量来确定加入特定培养基的体积，确保CD34+造血干细胞接种密度为5×104个/ml，间充质干细胞接种数量6×104个；每个T75培养瓶加入特定培养基的体积不得超过30ml；然后加入特定培养基，放置在37℃，二氧化碳浓度5%的培养箱培养，第6天，分别收集悬浮生长的造血干/祖细胞和贴壁生长的间充质干细胞，造血干/祖细胞与间充质干细胞按照50：1的数量比同时接种在T175培养瓶中，根据扩增后的造血干/祖细胞的数量来确定加入特定培养基的体积，确保造血干/祖细胞密度为1×106个/ml，间充质干细胞接种数量2×106个，每个T175培养瓶加入特定培养基的体积不得超过50ml；然后加入特定培养基，放置在37℃，二氧化碳浓度为5%的培养箱培养，培养4天后收获细胞；（4）将步骤（3）制备的造血干/祖细胞和间充质干细胞加入含有体积分数为5%AB脐血浆的生理盐水定容至两种干细胞的浓度分别为5×105/ml和2×105/ml，制成混合干细胞注射剂。