[发明专利]一种草鱼肿瘤坏死因子α基因的重组表达方法

摘要

本发明涉及草鱼肿瘤坏死因子alpha（TNF-α）蛋白重组表达及纯化技术。本发明提出草鱼肿瘤坏死因子α的原核重组表达方法，利用克隆技术得到草鱼肿瘤坏死因子α基因的cDNA全序列，并将草鱼肿瘤坏死因子α基因的成熟肽序列构建原核表达载体，筛选得到高效表达草鱼肿瘤坏死因子α的原核表达体系，并以IPTG诱导重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白的表达，利用亲和层析对表达产物进行多级纯化，获得高纯度体外表达重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白。通过本发明的技术方案可以工业化生产重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白，一方面用于淡水鱼类免疫机制的理论研究；另一方面用于鱼类免疫增强剂、病害防治药物等生产应用。

主权项

一种草鱼肿瘤坏死因子α基因的重组表达方法，其特征在于，利用草鱼肿瘤坏死因子α成熟肽的基因序列构建原核表达载体，筛选出一种用于高效表达草鱼肿瘤坏死因子α的重组表达体系，通过诱导表达和纯化从而获得具有活性的重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白；其具体步骤为：步骤1重组表达载体的构建：根据GenBank中草鱼肿瘤坏死因子α基因序列(HQ696609)，设计合成一对特异性引物TNF‑αeF5’‑CGGGATCCATGAGAGATCATTTTTCAAAAGC‑3’和TNF‑αeR5’‑CCGCTCGAGTTACAGAGCAAACACCCCAAAA‑3’，粗体部分为引入的酶切位点，TNF‑αeF为草鱼肿瘤坏死因子α成熟肽基因序列的上游扩增引物，引入的酶切位点为BamHI；TNF‑αeR为草鱼肿瘤坏死因子α成熟肽基因序列的下游扩增引物，引入的酶切位点为XhoI；采用PCR方法扩增出草鱼肿瘤坏死因子α的成熟肽的基因片段，将其克隆到pET30a(+)表达载体上，从而构建了重组表达质粒pET30a(+)‑gcTNF‑α。步骤2转化与筛选：将构建得到的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，进行PCR双向筛选鉴定；阳性克隆进行质粒纯化、限制性内切酶消化验证；最后再经过测序验证后获得的阳性克隆作为工程菌株。步骤3重组蛋白的表达及表达产物的分离纯化：将筛选所得的工程菌株，以异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷（IPTG)为诱导剂进行诱导表达；然后菌液经超声裂解并离心得到融合表达的裂解液，用镍离子亲和层析再以凝胶层析纯化，经SDS‑PAGE和Western blotting鉴定，获得有活性的重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白。