[发明专利]一种提高植物抗旱性的新方法

摘要

本发明提供的一种提高植物抗旱性的新方法，步骤1)SHR-1过量表达载体构建和农杆菌转化,其中提取拟南芥整株RNA，经反转录成为cDNA后，以SHR-F：5'ATGGATACTCTCTTTAGACTAG3'和SHR-R：5'TTACGTTGGCCGCCACGCACTAG3'为引物，PCR得到SHR-1的基因完整片段；选取正向克隆，利用BamHI和SalI两个酶切位点将SHR-1基因片段从KS载体上切下，并连入植物表达载体pCAMBIA1301中，构建pCAMBIA1301-SHR-1转入农杆菌GV3101备用；2）拟南芥干旱处理和失水率测定;3）RT-PCR和Real-TimePCR分析;4）水稻的遗传转化;5）PEG模拟干旱处理水稻，表达其提高的抗性效果。

主权项

一种提高植物抗旱性的新方法，其特征在于：分步骤实施；步骤1SHR‑1过量表达载体构建和农杆菌转化1）提取拟南芥整株RNA，经反转录成为cDNA后，以SHR‑F：5'ATGGATACTCTCTTTAGACTAG3'和SHR‑R：5'TTACGTTGGCCGCCACGCACTAG3'为引物，PCR得到SHR‑1的基因完整片段；2）用Ligation high试剂盒将其连入到pBluescript KS中间载体中，测序验证；3）选取正向克隆，利用BamHI和SalI两个酶切位点将SHR‑1基因片段从KS载体上切下，并连入植物表达载体pCAMBIA1301中；4）构建pCAMBIA1301‑SHR‑1转入农杆菌GV3101备用，即选取刚开花的拟南芥苗，每隔3‑5d转染一次，连续转染3‑5次备用；步骤2拟南芥干旱处理和失水率测定将萌发5d的拟南芥幼苗转移到土壤中，培养21‑25d后开始停止浇水，并继续培养21d，观察其表型；取培养28d的非转基因野生型和SHR‑1过表达株叶片，分别时间点称出鲜重，即得失水率；步骤3RT‑PCR和Real‑Time PCR分析1）利用Trizol reagent抽取植物RNA并利用ReverTra Ace，反转录成cDNA；2）RT‑PCR所用引物：SHR‑F：5'ATGGATACTCTCTTTAGACTAG3'；SHR‑R：5'TTACGTTGGCCGCCACGCACTAG3'；Atactin2F：5'GGAAGGATCTGTACGGTAAC3'；Atactin：5'GGACCTGCCTCATCATACT3'；3）反应流程：95℃1min、95℃15s、58℃30s、72℃15s；共30个循环；72℃，延伸反应5min；Real‑Time PCR按照SYBR Green Realtime PCR MasterMix说明书操作；步骤4水稻的遗传转化1）水稻成熟胚愈伤组织的诱导：将ZH11水稻种子去壳，用70%乙醇浸泡1min，再用20%次氯酸钠溶液浸泡20min，用无菌水洗涤3‑5次，无菌滤纸吸干浸泡溶液后播种在NB愈伤诱导培养基上，在26‑28℃下，暗培养28‑30d，将愈伤组织颗粒接种在新的NB愈伤诱导培养基上，暗培养4d备用；2）转化前一天将含有p1301proD1‑SHR‑1质粒的农杆菌接种于LB培养基中，28℃、200rpm震荡培养至OD66o为0.6‑0.8；3）将愈伤组织转移到无菌三角瓶中，倒入农杆菌菌液，即让菌液浸没愈伤组织；室温放置20min，倒去菌液，将愈伤转移到无菌滤纸上吸取多余菌液，然 后转到NB共培养基上，20‑25℃，暗中共培养2‑3d；4）将共培养后的愈伤组织转移到无菌三角瓶中，先用无菌水洗涤2‑3次，再用含500ml/L羧苄青霉素的无菌水洗涤20min；在无菌滤纸上吸干多余水分后，将愈伤组织转移到NB筛选培养基上进行转化细胞的筛选，筛选42‑65d；5）将筛选后的抗性愈伤转入预分化培养基上培养7‑20d，再转至NB分化培养基上培养，条件为26℃，16h光照/8h暗；分化出的抗性再生植株转入生根培养基上壮苗生根；21‑28d，将生根的再生抗性植株移栽至温室中；步骤5PEG模拟干旱处理水稻将萌发7‑10d后的野生型和转基因水稻幼苗分别种植，正常浇水培养14d，然后每天用200ml20%PEG水溶液,连续浇灌12‑15d，观察其表型。