[发明专利]一种对硝基苯胺生产工艺

摘要

本发明主要通过枯草芽孢杆菌胞外聚合物与二硝基苯常温反应生成对硝基苯胺。由于枯草芽孢杆菌易于大量培养，且本发明采用剔除有致病基因的工程枯草芽孢杆菌种来生产对硝基苯胺，所以是一种藉以生物工程为基础、以绿色环保为特点的对硝基苯胺制备工艺。以枯草芽孢杆菌胞外聚合物为前驱体采用绿色工艺生产对硝基苯胺。这些EPS既能起到还原剂的作用，又能起到电子传递的生物电子穿梭体作用。因此，是不可多得的一种对硝基苯胺制备材料，具有极高的应用和推广价值。

主权项

一种对硝基苯胺生产工艺，其特征在于：一种对硝基苯胺(或4‑硝基苯胺，英文名：p‑nitroaniline)的生产步骤如下，(1)M9培养基制备：该工艺使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生物菌种作为微生物胞外聚合物(EPS)来源，属于非致病性菌种，优点是生长速度快，24小时内即进入生长稳定期，EPS即Extracellular Polymeric Substances的缩写；该枯草芽孢杆菌生物菌种使用M9培养基培养，所述M9培养基制备步骤如下，1)M9主培养基配方为：单位为毫摩尔每升，在1L烧杯中加入450mL蒸馏水和以下各成份配成溶液：NH4Cl0.5g，Na2HPO43.0g，KH2PO41.5g，用NaOH调整pH到7.0‑7.5并将溶液体积调整至490‑500mL，制得主培养基；2)制备M9营养液各50ml，如下：1mol/LMgSO4.7H2O50ml；15‑30％(w/v)Dextrose葡萄糖50ml，w/v即质量浓度；和1mol/LCaCl250ml。将上述M9主培养基和3种50ml的M9营养液分别通过0.45um滤膜抽滤除菌，或者分别在120℃高压灭菌20分钟，灭菌后，无菌条件下取浓度为1mol/L的1mL MgSO4·7H2O、20％(w/v)的5ml葡萄糖及1mol/L的50mL氯化钙的营养液分别加入到M9主培养基，充分混匀制得M9培养基备用。(2)枯草芽孢杆菌的培养及其胞外聚合物EPS提取该方法使用枯草芽孢杆菌生物菌种作为微生物胞外聚合物(EPS)来源；枯草芽孢杆菌首先在无菌环境接种至所述M9培养基中，接种比为5∶1000～5000；接种后的培养基在37±1℃，150转/分钟培养箱中培养24‑48小时；在所述24‑48小时期间，是微生物胞外聚合物EPS增生阶段，培养48小时能获得最大胞外聚合物(EPS)提取量；微生物胞外聚合物(EPS)提取方法：第1步：取所述M9培养基培养48小时的枯草芽孢杆菌液1L，在6000g离心力下离心分离，移除上清液，收集沉淀下来的细胞；加入去离子水至原体积以重新悬浮枯草芽孢杆菌菌体，6000g离心力下再次离心，移除上清液，收获沉淀至离心管底的细胞体；该过程再次加入去离子水的目的是清洗枯草芽孢杆菌细胞，以移去残余培养基；第2步：将所述第1步沉淀至离心管底的细胞体加入去离子水重新悬浮至500mL，在40～60W功率下超声10分钟得溶液备用；目的是增加微生物表面EPS的可剥离度；第3步：将所述第2步超声后所得溶液，在11000～20000g离心力下离心20分钟；用高速离心的方法把微生物表面EPS剥离；第4步：离心后的上清液经0.45um滤膜抽滤，获得的抽滤液为枯草芽孢杆菌EPS溶液， 溶液保存在0～4℃环境；第5步：上述提取的枯草芽孢杆菌胞外聚合物(EPS)经冷冻干燥、浓缩为原浓度的1％的微生物胞外聚合物(EPS)浓缩液备用；(3)对硝基苯胺制备方法第1步：取对二硝基苯，用甲醇配制成200g/L的对二硝基苯母液；将所述对二硝基苯母液加入到1L步骤(2)所述的浓缩至1％的微生物胞外聚合物(EPS)浓缩液中，使对二硝基苯浓度达到2g·L‑1；第2步：将上述第1步混合液在37℃、150转速/分钟下水平振荡反应48小时；第3步：对于对硝基苯胺的收集；对于所述第2步水平振荡反应48小时后的混合液，2g/L的对二硝基苯完全转化为对硝基苯胺；转化后的溶液是EPS和对硝基苯胺的混合溶液，负60℃下冷冻干燥5天；所获取的干燥样品是固态EPS和对硝基苯胺混合物；加入甲醇经80W超声30min直接从固相微生物胞外聚合物(EPS)混合物中萃取对硝基苯胺，分3次萃取；所获得的对硝基苯胺甲醇溶液，在40℃条件下旋转蒸发；所搜集的甲醇蒸出液能重复使用；固体物为对硝基苯胺。