[发明专利]左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立

摘要

左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，主要步骤如下：1.对志贺菌进行左氧氟沙星等12种抗生素药敏试验，挑选出敏感株做诱导实验；2.测左氧氟沙星对诱导株原代MIC₀；3.将单菌落至左氧氟沙星细菌液体培养基中培养；4.取步骤3中菌液至左氧氟沙星细菌液体培养基中传一代，取菌液至左氧氟沙星液体培养基中传两代，药物浓度达到敏感与中介临界值前依次将左氧氟沙星浓度倍增培养细菌，当药物浓度达到敏感与耐药临界值后依次将左氧氟沙星浓度递增培养；当诱导抗菌药物浓度达到2、4、8µg/ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天，生长良好的单菌落诱导培养得到志贺菌诱导耐药谱型，对该诱导耐药谱型的菌株进行基因突变分析。

主权项

左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，其特征在于，主要方法步骤如下：  用纸片琼脂扩散法对志贺菌进行头孢唑啉、头孢噻肟、氨苄西林、庆大霉素、氯霉素、四环素、复方新诺明、萘啶酸、吡哌酸、环丙沙星、诺氟沙星及左氧氟沙星12 种抗生素的药敏试验，以对12种抗菌药物均敏感的为敏感株，判断细菌敏感、中度敏感或耐药，将敏感株于细菌固体培养基平板上划线培养，选取生长良好的单菌落做诱导实验；用琼脂稀释法测定左氧氟沙星对诱导株原代的最低抑菌浓度MIC₀，左氧氟沙星敏感、中介、耐药标准依次为MIC（μg/ml）≤2、2~8、≥8；从实验诱导株的细菌固体培养基平板上挑取生长良好的单菌落至至少五管左氧氟沙星浓度为1/4×MIC₀的细菌液体培养基中，32℃~39℃震荡培养细菌生长至对数期OD600=0.6~1；取步骤（3）中一定量菌液至至少五管左氧氟沙星含量为1/4× MIC₀的细菌液体培养基中再传一代，然后再取一定量菌液至左氧氟沙星浓度为1/2× MIC₀的液体培养基中传两代，在药物浓度达到敏感与中介临界值前，依次将左氧氟沙星浓度倍增培养细菌，当药物浓度达到敏感与耐药临界值后依次将左氧氟沙星浓度递增培养，每次递增1μg/ml；当诱导抗菌药物浓度达到2、4、8µg/ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天后，暂不诱导传代，先做至少两次无诱导剂传代培养后，再接种于含相同浓度诱导剂的细菌固体培养基平板上过夜培养，挑选生长良好的单菌落继续诱导培养，最终得到至少五组志贺菌诱导耐药谱型，对该诱导耐药谱型的菌株进行基因突变分析；在诱导传代的过程中，采用琼脂稀释法测定左氧氟沙星对实验诱导株各代的MIC，左氧氟沙星敏感、中介、耐药标准依次为MIC（μg/ml）≤2、2~8、≥8；构建左氧氟沙星诱导多组志贺菌耐药基因突变模型，以此进行诱导耐药基因突变时序分析。