[发明专利]多重PCR检测方法及试剂盒

摘要

本发明公开了多重PCR检测方法及试剂盒。本发明所提供的多重PCR检测方法，包括以下步骤：（1）根据靶标基因序列，分别设计上游引物、下游引物、共同引物和探针序列；（2）配置多重PCR反应体系；（3）进行PCR扩增，在PCR扩增周期结束后，进行熔解曲线分析。本发明在PCR扩增过程中针对每一扩增子引入特异性外源核酸序列标签，在扩增过程中与之后采用完全互补与有限错配的单标记荧光寡聚合核苷酸探针荧光杂交与熔解分析实现多重检测。本发明所提供的多重PCR检测方法，有效地提高了实时荧光定量PCR的检测重数、检测通量，并缩短检测时间。

主权项

一种多重PCR检测方法，包括以下步骤：（1）根据靶标基因序列，分别设计上游引物、下游引物、共同引物和探针序列：所述上游引物与靶标基因序列的上游序列相同；所述下游引物由3'端特异结合区、外源标签序列区和下游共同引物区三部分组成；所述3'端特异结合区与靶标基因序列特异杂交；所述外源标签序列区与所述探针序列完全互补或含有限数目核苷酸错配；所述下游共同引物区与所述共同引物序列相同；所述共同引物的3'端标记荧光素；所述探针序列与目的基因序列无显著同源性，且3'端标记荧光素；（2）配置多重PCR反应体系：所述多重PCR反应体系包括：Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、Mg2+、dNTP、探针、上游引物、下游引物和共同引物，其中，上游引物与下游引物浓度相同，共同引物浓度为上游引物或下游引物浓度的10‑20倍；（3）进行PCR扩增，在PCR扩增周期结束后，进行熔解曲线分析；当探针与外源标签序列完全匹配时，Tm值最高；Tm值随着探针与外源标签序列的错配数目增多而降低。