[发明专利]一种绵羊肺炎支原体灭活疫苗的制备工艺

摘要

本发明一种绵羊肺炎支原体灭活疫苗的制备工艺，改良了绵羊肺炎支原体灭活疫苗的制备工艺，提供了一种绵羊肺炎支原体灭活疫苗的制备方法。本发明所述的方法筛选到理想的绵羊肺炎支原体高效灭活疫苗佐剂，并使抗原内毒素含量大大降低，提高了疫苗安全性。疫苗免疫羊只后，抗体产生早、效价高、持续时间长，可有效防控绵羊肺炎支原体感染。

主权项

一种绵羊肺炎支原体灭活疫苗的制备工艺，其特征在于操作步骤如下：A．抗原制备(1) 培养基的制备采用改良Thiaucourt’s培养基；培养基成分如下：PPLO肉汤 21.0 g，新鲜酵母浸出液 100 mL，灭活马血清200 mL，0.5g/ml的葡萄糖2ml，0.5g/mL的丙酮酸钠8 ml，0.5%酚红3.2 ml，10000U/mL青霉素10 ml，醋酸铊 0.1 g，用去离子水补足到1000 mL，调节pH值7.6～7.8，经0.22µm细菌滤器过滤除菌后分装，于4℃保存备用；(2) 绵羊肺炎支原体的增殖取绵羊肺炎支原体冻干菌种加入1 mL改良Thiaucourt’s培养基溶解，将1 mL菌液接入10 mL改良Thiaucourt’s培养基，37℃ 160 rpm摇床培养48 h（培养基颜色由红色逐渐变成橙黄色，菌液澄清透亮、无菌膜、无混浊现象）时收获；将第一代培养物按3%接种量接种于改良Thiaucourt’s培养基，置于37 ℃条件下160 r/min空气浴摇床培养20 h，连续传代至第4代，测定其活菌滴度即颜色变化单位（color chang unite，CCU）；(3) 绵羊肺炎支原体培养物的浓缩取绵羊肺炎支原体培养物12000rpm离心30min，菌体用pH7.2  0.15mol/L 的PBS重悬，将浓度调整至109CCU/mL；(4) 抗原灭活及内毒素的去除  将浓缩后的培养物置60 ℃水浴1 h，加入0.05%甲醛（v/v）及终浓度0.02%的重铬酸钾溶液，置37 ℃ 160 r/min空气浴摇床24h，进行灭活和去除内毒素；(5) 灭活检验随机抽样灭活的绵羊肺炎支原体，分别接种改良Thiaucourt’s培养基 2支，置37 ℃，160 r/min空气浴摇床培养3日，无支原体生长者为灭活完全； B. 疫苗配制采用一步乳化法，制备成油包水型乳剂疫苗水相成分：向绵羊肺炎支原体灭活抗原中加入万分之一的硫柳汞溶液，水相成分占疫苗总量的30%～35%；油相成分：ISA‑760油佐剂，油相成分占疫苗总量的65%～70%；乳化方法：将ISA‑760佐剂在高速搅拌器中缓慢搅拌乳化1‑2 min，然后再取抗原缓慢加入，快速搅拌直至乳化完全，疫苗抗原终浓度为l09 CCU/mL，乳化成粘性的油包水油乳剂灭活苗；C. 疫苗的物理性状检验及无菌检验该疫苗为油包水型，外观呈乳白色，3000rpm离心15min不分层；用出口内径为1.2mm的1mL细管，吸取25℃的疫苗1mL，令其垂直自然流出0.4mL的时间为4秒；无菌检验按中华人民共和国兽药典（2005版）附录15页进行，均无细菌生长。