[发明专利]一种大肠杆菌生物膜检测方法-96孔半定量法

摘要

本发明公开了一种针对大肠杆菌生物膜检测方法-96孔半定量法，所述方法以大肠杆菌为实验材料，通过将其复苏、活化，常规培养至对数生长期、测定OD600、释稀OD600nm值至0.01、上96孔板、37℃培养、洗板、固定、染色、溶解、测定等步骤，得到大肠杆菌生物膜阳性。该方法具有可比性强，重复性高，易操作等优点。可用于大批量大肠杆菌生物膜的筛选工作。

主权项

一种针对大肠杆菌生物膜检测方法‑96孔半定量法，其特征在于，包括以下步骤：(1)从‑70℃冰箱中取出甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取100μL菌液接种于5mL LB液体培养基中，于37℃过夜震荡培养；(2)将菌液接种于麦康凯固体培养基中，置于37℃恒温培养箱内培养24h；(3)从麦康凯培养基中挑取红色单菌落，接种到新鲜的LB液体培养基，37℃恒温振荡培养16h；(4)按1∶100倍稀释：取培养的菌液50μL于新鲜的5mL LB试管液体培养基上，于37℃缓慢震荡4.5h，保证细菌处于对数生长期；(5)测OD600nm(6)用灭菌的M9培养基将所测OD600nm值稀释至0.01；(6)取200μL稀释至0.01菌液加入96孔U型平底板中，用M9液体培养基作为空白对照，于37℃恒温箱中分别培养24‑48h；(7)将培养好的96孔U型平底板从恒温箱中取出，弃菌液；(8)用1％PBS缓冲液洗96孔U型平底板，重复三次，弃洗液，拍干；(9)将甲醇放入96孔U型平底板中固定15min，倒出并晾干；(10))将1％结晶紫溶液加入96孔U型平底板中，染色5min，自来水缓慢冲洗多次，晾干，观察板底部有无生物膜形成；(11)用33％的冰醋酸加于96孔U型平底板中，待细菌生物膜完全 溶解后，用全波长酶标仪中测定OD600nm，测定OD600nm值减去空白对照孔的OD600nm值大于等于0.12则可判定其为生物膜阳性。