[发明专利]一种检测单核苷酸多态性的方法

摘要

本发明属于分子生物学技术领域，涉及单核苷酸多态性的分析检测，具体涉及一种普适的利用缺口-连接酶链式反应扩增目标DNA，将DNAzyme序列引入连接产物中，然后利用Lambda外切酶降解没有参与连接反应的磷酸化探针，及外切酶III释放DNAzyme的检测方法。本发明将DNAzyme探针与Gap-LCR探针相结合，通过在LCR体系中的待连接的一个磷酸化探针中加入一段DNAzyme序列，Gap-LCR扩增反应结束以后，向体系中加入Anti-G序列（与探针中的DNAzyme序列部分互补配对），利用Lambda外切酶降解5端磷酸化的DNA探针，然后利用外切酶III释放连接产物中的DNAzyme，通过DNAzyme的特性来进行SNP的定性和定量检测。本发明具有简单、方便、实用、经济，广泛适用于各种单核苷酸多态性检测。

主权项

一种检测单核苷酸多态性的方法，其特征是：在连接酶链式反应Ligase Chain Reaction或者缺口‑连接酶链式反应Gap‑LCR体系中加入两组探针，其中一个5端磷酸化探针的3端用DNAzyme标记，在进行目标核酸的链式连接酶扩增反应过程中，依次在DNA聚合酶和DNA连接酶的作用下将DNAzyme引入到扩增产物中，LCR扩增以后，向扩增的产物中引入能与DNAzyme的序列部分互补的阻断序列Anti‑G，同时加入终浓度为100mM的NaCl以促进Anti‑G和DNAzyme更好的形成双链结构，然后利用Lambda外切酶选择性切割双链DNA中的5端磷酸化的DNA探针，而对连接产物不起作用，此时体系中主要存在着没有磷酸化的探针和连接产物，接着利用外切酶III降解双链DNA的3端为平末端或者凹陷末端的序列，从DNA链的3’端释放单磷酸核苷酸，产生单链DNA片段，将连接产物中的DNAzyme标记释放，通过检测LCR消化产物中释放出的DNAzyme标记物来进行单核苷酸多态性的定性或定量分析；寡核苷酸探针中一般含有一段15个碱基以上的序列能与目标核酸序列互补，阻断序列Anti‑G与DNAzyme序列大约有12个碱基的序列完全互补配对，使DNAzyme序列处于封闭状态，以保证Lambda外切酶能够彻底消化LCR扩增反应以后体系中剩余的含DNAzyme序列的磷酸化探针，从而降低检测背景。