[发明专利]一种大曲细菌DGGE标准条带制作方法

摘要

本发明涉及一种大曲细菌DGGE标准条带的制备及应用，通过在大曲发酵过程中对优势细菌的检测，获得细菌DGGE指纹图谱，选取发酵过程中常见的优势细菌DGGE条带，制备细菌DGGE标准条带，并将其应用于发酵阶段微生物种群的定性检测。

主权项

一种大曲细菌DGGE标准条带制作方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1，获得大曲发酵过程中的细菌DGGE图谱，确定大曲发酵过程中优势细菌；步骤2，根据大曲中优势细菌，制备大曲细菌DGGE标准条带；其中步骤1的方法如下：l)选取大曲不同发酵阶段的合格样品；2)提取微生物总DNA；3)以微生物总DNA为模板，在专用引物的引导下进行细菌16S rDNA V3可变区的PCR扩增：所述细菌16S rDNA V3可变区的PCR扩增使用巢式PCR扩增，以待测样品的微生物总DNA为模板，先加入第一步扩增引物和反应体系进行扩增，第一步扩增采用的引物为16S1：5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3'和16S2：5’‑TACGGYTACCTTGTTACGAC TT‑3'；取其产物作为模板，加入第二步扩增引物进行扩增，第二步扩增采用的引物为：R518：5’‑ATTACCGCGGCTGCTGG‑3’和338F‑GC：5’‑CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG‑3’；4)对扩增后的产物进行变性梯度凝胶电泳，方法是：采用10％变性聚丙烯酞胺凝胶电泳进行分离，变性剂浓度30‑60％，电泳缓冲液采用1×TAE，电压100V，时间10h，经SYBR Green I染色后得到DGGE图谱；5)将图谱中的优势条带进行切胶回收，在专用引物338F：5’‑ACTCCTACGGGAGGCAGCAG‑3’和R518：5’‑ATTACCGCGGCTGCTGG‑3’的引导下进行PCR扩增，产物测序，所得序列在NCBI上与已登陆序列进行比对，从而确定优势细菌；其中步骤2的方法如下：l)取优势细菌所对应的DGGE条带，在专用引物R518：5’‑ATTACCGCGGCTGCTGG‑3’和338F‑GC：5’‑CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG‑3’的引导下进行PCR扩增；2)将扩增产物等量混合，对其进行变性梯度凝胶电泳，经SYBR Green I染色，确定每种菌所代表的条带的相对位置，即得DGGE优势细菌标准条带；其中，制得的DGGE优势细菌标准条带中共包含16个条带，指示13种细菌，分别为：Genebank登陆号JX202610.1：Lactobacillus fermentum、Genebank登陆号AB685610.1：Pseudomonas fragi、Genebank登陆号HQ658810.1：Pseudomonas sp.、Genebank登陆号HE663132.1：Lactobacillus panis、Genebank登陆号HM218420.1：Lactobacillus pontis、Genebank登陆号GQ487537.1：Bacillus cereus、Genebank登陆号JN366706.1：Bacillus sp.、Genebank登陆号JX129894.1：Bacillus licheniformis、Genebank登陆号FN666891.1：Bacillus thermoamylovorans、Genebank登陆号JQ796004.1：Bacillus thermoamylovorans、Genebank登陆号JX403943.1：Bacillus subtilis、Genebank登陆号EF377301.1：Bacillus sp.、Genebank登陆号JN010261.1：Saccharopolyspora rectivirgula。